常溫大氣壓等離子體對(duì)番茄種帶細(xì)菌的滅菌效果

王玲玲 尚慶茂 李倩

摘要 為了明確常溫大氣壓等離子體（atmospheric pressure room-temperature plasma，APRTP）在番茄種子消毒中的應(yīng)用效果，以‘中雜302種子為材料，采用平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)和16S rRNA拷貝數(shù)分析法，測(cè)定了APRTP處理對(duì)種子表面和內(nèi)部細(xì)菌的滅菌效果。結(jié)果表明，APRTP處理對(duì)種帶細(xì)菌的滅菌效果顯著，在5～30 min處理時(shí)間內(nèi)，滅菌率隨處理時(shí)間延長(zhǎng)逐漸升高，處理25 min對(duì)種子表面和內(nèi)部細(xì)菌的滅菌率達(dá)99%以上；番茄種子接種細(xì)菌性潰瘍病致病菌—密執(zhí)安棒桿菌密執(zhí)安亞種（Cmm）后，采用APRTP處理25 min可有效殺滅99.84%的種帶Cmm菌；種子活力檢測(cè)表明，APRTP處理可提高番茄種子活力，加快種子萌發(fā)速率，APRTP處理過(guò)的種子播種后，對(duì)幼苗早期生長(zhǎng)不會(huì)造成傷害。綜上，APRTP處理可顯著殺滅番茄種帶細(xì)菌，提高種子活力、促進(jìn)種子萌發(fā)，是一種安全、高效的番茄種子處理方法。

關(guān)鍵詞 常溫大氣壓等離子體； 番茄； 種帶細(xì)菌； 種子活力

中圖分類(lèi)號(hào)： S 436

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018042

Abstract Cultivar ‘Zhongza 302 seeds were used as materials to evaluate the sterilization effects of atmospheric pressure room-temperature plasma （APRTP） on seeds during tomato seed treatment. The bacteria on seed surface and in the seed were determined by analyzing the number of culturable bacteria and the 16S rRNA copies. The results showed that the sterilization effects of APRTP on tomato seed-borne bacteria were significant. The sterilization rate increased with the APRTP processing time increased from 5 to 30 minutes， and the sterilization rate could reach to more than 99% after APRTP treatment for 25 min for both surface bacteria and internal bacteria in the seed. APRTP was used to eliminateClavibacter michiganensis subsp.michiganensis （Cmm） inoculated to tomato seeds， the sterilization rate to Cmm could reach to 99.84% when samples were processed for 25 min. Furthermore， detection of seed vigor showed that APRTP treatment could increase the seed vigor， and thereby improve the germination potential and accelerate seed germination. After sowing， the APRTP-treated seeds showed no significant damages for the seedlings growth and development. Taken together， APRTP treatment showed significant sterilization effects on seed-borne bacteria and increased the seed vigor， indicating that it was an efficient and safe method for tomato seed treatment.

Key words atmospheric pressure room-temperature plasma； tomato； seed-borne bacteria； seed vigor

番茄Lycopersicon esculentumMill.是世界主栽蔬菜作物之一。番茄種子在制種、采收、運(yùn)輸、包裝、貯存等各個(gè)環(huán)節(jié)都可能受到多種病原菌的侵染，導(dǎo)致其表面和內(nèi)部帶菌，帶菌的種子是番茄苗期和成株期病害的主要初侵染源[1-2]。常見(jiàn)的番茄種傳病害如早疫病、炭疽病、枯萎病等真菌性病害，以及細(xì)菌性潰瘍病、斑疹病、瘡痂病等細(xì)菌性病害對(duì)產(chǎn)量和品質(zhì)造成了巨大損失[1-4]。由密執(zhí)安棒桿菌密執(zhí)安亞種Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis（Cmm）引起的番茄細(xì)菌性潰瘍病近年來(lái)在國(guó)內(nèi)外頻繁發(fā)生，造成的產(chǎn)量損失最高達(dá)80%以上[5]。對(duì)番茄種子進(jìn)行消毒處理，對(duì)于防治種傳病害、降低發(fā)病率具有重要作用。

常規(guī)種子消毒處理方法有物理消毒法（如溫湯浸種、干熱滅菌、輻照殺菌等）、化學(xué)藥劑消毒（浸種、拌種等）和生物防治法等[6-7]。然而，溫湯浸種和干熱滅菌對(duì)耐熱性強(qiáng)的微生物殺菌效果不佳，溫度過(guò)高會(huì)影響種子發(fā)芽[6]，輻射處理對(duì)種子發(fā)芽有顯著抑制作用，且易誘變[8]。藥劑浸種一般用藥量大，易產(chǎn)生藥劑殘留，既影響種子活力，又會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染[9]，且殺菌劑僅對(duì)一種或幾種病原菌起作用，消毒不徹底，部分種帶病原菌甚至對(duì)殺菌劑產(chǎn)生抗藥性[10]。生物防治法雖然安全、環(huán)保，但防治效果十分不穩(wěn)定[11]。因此，廣譜、高效、無(wú)毒、對(duì)種子無(wú)副作用的消毒技術(shù)是種子消毒處理的發(fā)展趨勢(shì)。

常溫大氣壓等離子體（atmospheric pressure room-temperature plasma，APRTP）是一種常溫非平衡等離子體，是氣體在大氣壓下由于受到外部強(qiáng)輻射、高電壓或高強(qiáng)度磁場(chǎng)的作用而形成的接近室溫（25～40℃）的等離子體，其中含有大量活性物質(zhì)，包括帶電粒子、具有化學(xué)活性的亞穩(wěn)態(tài)物質(zhì)（如臭氧、OH-自由基、氧原子、H2O2等）[12]。APRTP與樣品密切接觸，可對(duì)樣品表面微生物進(jìn)行殺滅和分解[13-15]，因此APRTP已成為近年來(lái)一種新型的消毒技術(shù)，并因其殺菌效率高、處理時(shí)間短、無(wú)殘留等特點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于醫(yī)用消毒、果蔬保鮮、農(nóng)產(chǎn)品消毒等方面[16-17]。APRTP處理可以有效地減少蘋(píng)果、檸檬、萵苣等果蔬表面的大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、單核增生性李斯特菌、酵母菌等的數(shù)量，果蔬保鮮時(shí)間顯著延長(zhǎng)[18-20]。在APRTP種子處理方面，研究人員在小麥、大豆、油菜等農(nóng)作物上也進(jìn)行了一些嘗試。研究者發(fā)現(xiàn)，在100 W/cm3的處理強(qiáng)度下，APRTP處理60 s可將接種于小麥種子表面的致病性鐮刀菌Fusarium nivale、F. culmorum全部殺滅[21]。在油菜Brassica campestris種子表面接種黑腐病致病菌Xanthomonas campestris，APRTP處理5 min后，種子帶菌量由6.6 log cfu減少到2.7 log cfu，處理40 min時(shí)，種子所帶病原菌幾乎被全部殺滅[22]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，APRTP處理可一定程度上提高小麥、大豆等種子的發(fā)芽勢(shì)和活力指數(shù)[23-24]。然而，對(duì)于蔬菜種子，尤其是番茄種子，目前尚無(wú)APRTP處理效果的研究報(bào)道。

本試驗(yàn)以番茄種子為材料，分析APRTP處理不同時(shí)間對(duì)種子表面和內(nèi)部所帶細(xì)菌的滅菌效果以及對(duì)種子活力和幼苗生長(zhǎng)的影響，以期為番茄種子處理提供更加安全、高效的消毒技術(shù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)裝置及供試材料

APRTP裝置由南京克普醫(yī)療科技有限公司研發(fā)，工作電壓220 V，頻率50 Hz，功率100 W，進(jìn)氣量20 L/min。該裝置由氣泵、等離子體發(fā)生系統(tǒng)和氣體管路等組成（圖1）。工作時(shí)將起泡石浸沒(méi)于水中，氣泵壓縮空氣進(jìn)入等離子體發(fā)生系統(tǒng)內(nèi)部的放電腔室中，生成的等離子氣體通過(guò)氣體管路進(jìn)入水中，產(chǎn)生活性水。

試驗(yàn)用電導(dǎo)儀選用雷磁DDSJ-308A型，多功能pH計(jì)選用SG23-FK-CN型（Mettler-Toledo，美國(guó)），配置LE438電極和LE501電極，分別用于測(cè)定pH和氧化還原電位（ORP）。

番茄品種‘中雜302由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所培育。番茄細(xì)菌性潰瘍病致病菌Cmm由中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（Agricultural Culture Collection of China）提供，菌株編號(hào)01233。

1.2 APRTP處理番茄種子

稱(chēng)取番茄種子15 g，去離子水浸種6 h后，置于裝有900 mL無(wú)菌水的燒杯中，將起泡石浸沒(méi)于無(wú)菌水中，通入APRTP進(jìn)行處理。處理時(shí)間分別為5、10、15、20、25、30 min（依次記為P5、P10、P15、P20、P25、P30），以未經(jīng)處理的番茄種子作為對(duì)照（CK），以5% NaClO溶液消毒10 min的種子[25]作為陽(yáng)性對(duì)照。

1.3 番茄種帶細(xì)菌的分離培養(yǎng)

番茄種子表面所帶細(xì)菌的分離參照Links等[26]的方法，分別隨機(jī)選取不同處理的種子各1 000粒，置于50 mL無(wú)菌三角瓶中，加入20 mL無(wú)菌PBS溶液（NaCl 8 g/L、KCl 0.2 g/L、Na2HPO4 1.44 g/L、KH2PO4 0.24 g/L，pH 7.4），25℃、150 r/min振蕩2 h，振蕩液經(jīng)5 000 r/min離心20 min，棄上清， PBS溶液重懸沉淀，即為種子表面所帶菌的菌懸液。

番茄種子內(nèi)部細(xì)菌的分離參照已有的文獻(xiàn)報(bào)道[27-28]，并加以改進(jìn)，種子表面經(jīng)滅菌處理（依次為80%乙醇2 min，5% NaClO 10 min）后，置于無(wú)菌研缽中研磨，研磨物中加入無(wú)菌PBS溶液，150 r/min振蕩2 h，經(jīng)無(wú)菌紗布過(guò)濾，濾液5 000 r/min離心20 min，PBS溶液重懸沉淀，得到種子內(nèi)部帶菌的菌懸液。

將上述所得菌懸液按10倍梯度稀釋后，分別涂布于TSA培養(yǎng)基（胰蛋白胨15 g/L、大豆蛋白胨5 g/L、NaCl 5 g/L、瓊脂粉15 g/L，pH 7.0）上，37℃倒置培養(yǎng)12～16 h后，觀察、計(jì)數(shù)。

1.4 番茄種帶細(xì)菌16S rRNA拷貝數(shù)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）法測(cè)定樣品中細(xì)菌的16S rRNA拷貝數(shù)[26]。

1.4.1 16S rRNA拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

提取大腸桿菌Escherichia coliDH5α的基因組DNA，采用細(xì)菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）擴(kuò)增16S rRNA序列，采用Zymoclean Gel DNA Recovery Kit（ZYMO， USA）對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行切膠回收，并采用NanoDrop 2000（Thermo Scientific，USA）測(cè)定其濃度。使用ddH2O稀釋DNA至濃度為1、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6 ng/μL（1 ng模板對(duì)應(yīng)的16S rRNA拷貝數(shù)為6.14×108），并以此為模板，采用通用引物SRV3-1（5′-CGGTCCAGACTCCTACGGG-3′）和SRV3-2（5′-TTACCGCGGCTGCTGGCAC-3′）對(duì)16S rRNA的V3區(qū)進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系（20 μL）為：2×Top Green qPCR SuperMix（全式金，北京）10 μL，引物（10 μmol/L）各0.5 μL，模板1.0 μL，用ddH2O補(bǔ)足20 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性5 min；95℃變性10 s，55℃復(fù)性10 s，72℃延伸10 s，45個(gè)循環(huán)。以模板中16S rRNA拷貝數(shù)的log10值為橫坐標(biāo)，以Real-time PCR所得的Ct值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.2 番茄種帶細(xì)菌16S rRNA拷貝數(shù)分析

取番茄種子表面和內(nèi)部所帶菌的菌懸液，利用FastDNATMSpin Kit for Soil試劑盒（MPbio，USA）提取基因組DNA，并采用普通DNA產(chǎn)物純化試劑盒（天根，北京）對(duì)提取的基因組DNA進(jìn)行純化。采用NanoDrop 2000測(cè)定DNA濃度。以純化后的細(xì)菌基因組DNA為模板，利用細(xì)菌通用引物SRV3-1和SRV3-2進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系和程序同1.4.1。根據(jù)Real-time PCR反應(yīng)的Ct值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出各處理番茄種子表面和內(nèi)部帶細(xì)菌的16S rRNA拷貝數(shù)。

1.5 番茄種子人工接種Cmm菌與計(jì)數(shù)

1.5.1 番茄種子Cmm菌的人工接種

Cmm菌由中國(guó)農(nóng)業(yè)微生物菌種保藏管理中心（Agricultural Culture Collection of China）提供，菌株編號(hào)01233。Cmm菌活化后，接種于少量NB培養(yǎng)基（蛋白胨10 g/L、牛肉提取物3 g/L、NaCl 5 g/L，pH 7.0）中，在30℃、150 r/min下振蕩培養(yǎng)至數(shù)量級(jí)為109cfu/mL，以1%的接種量接種于300 mL NB培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600為0.3～0.5。培養(yǎng)物在4℃、3 000 r/min離心15 min，棄上清，將菌體沉淀用無(wú)菌水重懸至菌濃度為108 cfu/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

稱(chēng)取番茄種子15 g，去離子水浸種2 h，5% NaClO溶液消毒10 min，無(wú)菌水沖洗5遍后，將種子浸沒(méi)于Cmm菌懸液（1∶20，體積比）中6 h，種子取出后無(wú)菌條件下晾干。

1.5.2 番茄種帶Cmm菌的計(jì)數(shù)

將人工接種Cmm菌的番茄種子分別用APRTP處理0（CK）、5、10、15、20、25、30 min，方法同1.2。不同處理的種子各隨機(jī)選取1 000粒置于無(wú)菌三角瓶中，加入無(wú)菌PBS溶液，150 r/min振蕩2 h，將菌懸液用無(wú)菌水按10倍梯度稀釋后，涂布于NA培養(yǎng)基上，30℃倒置培養(yǎng)48～72 h，觀察、計(jì)數(shù)。

人工接種Cmm菌的番茄種子經(jīng)APRTP處理后，提取種帶微生物DNA，并以此為模板，采用Cmm菌特異性引物PSA-4（5′-TCATTGGTCAATTCTGTCTCCC-3′）和PSA-R（5′-TACTGAGATGTTT-CACTTCCCC-3′）進(jìn)行Real-time PCR擴(kuò)增[29]。DNA提取以及PCR反應(yīng)體系和程序同1.4.1。根據(jù)Real-time PCR反應(yīng)的Ct值，計(jì)算種帶Cmm菌的相對(duì)數(shù)量，設(shè)定CK種子所帶Cmm菌的數(shù)量為1.0。

1.6 番茄種子萌發(fā)率和活力測(cè)定

取不同處理的番茄種子，置于鋪有三層無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中，加入10 mL無(wú)菌水使濾紙充分浸濕，每皿放置100粒種子，每處理設(shè)3次重復(fù)，于28℃恒溫催芽箱中進(jìn)行萌發(fā)，每隔0.5 d（12 h）統(tǒng)計(jì)種子發(fā)芽數(shù)（以胚根破殼或露白作為種子發(fā)芽的標(biāo)志），計(jì)算發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)[23]：

發(fā)芽勢(shì)=（3 d內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)）×100%；

發(fā)芽率=（7 d內(nèi)正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子總數(shù)）×100%；

發(fā)芽指數(shù)Gi=∑Gt/Dt（Gt表示第t天發(fā)芽種子數(shù)，Dt表示相應(yīng)的發(fā)芽天數(shù)）；

活力指數(shù)Vi=Gi×S（Gi表示發(fā)芽指數(shù)，S表示種子發(fā)芽長(zhǎng)度）。

種子活力的測(cè)定參照鄒琦[30]的方法，分別取萌發(fā)0、24、48 h的不同處理的番茄種子各50粒，沿種胚縱切，置于0.1%的氯化四氮唑（TTC）溶液中，38℃條件下黑暗染色4 h。利用丙酮提取種子中TTC的還原產(chǎn)物—三苯基甲臜（TTF），利用分光光度計(jì)（UV-1700，Shimadzu）測(cè)定480 nm波長(zhǎng)下的吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算種子活力。種子活力以每克種子每小時(shí)生成的TTF的量表示。

1.7 番茄幼苗生長(zhǎng)指標(biāo)的測(cè)定

將不同處理的番茄種子播種于裝有草炭、蛭石、珍珠巖（3∶1∶1，V/V）混合基質(zhì)的72孔穴盤(pán)中，每穴孔一粒種子。播種后15 d，每處理隨機(jī)抽取20株幼苗測(cè)定株高、莖粗、根體積、地上部干重、鮮重和根干重、鮮重，計(jì)算壯苗指數(shù)，測(cè)定方法參照禇群等[25]。

壯苗指數(shù)=莖粗（mm）/株高（mm）×全株干重（mg）。

1.8 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)結(jié)果采用3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，采用Excel 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，采用SPSS軟件進(jìn)行方差分析，運(yùn)用鄧肯氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性（P<0.05）檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄種子APRTP處理液pH、EC和ORP的變化

APRTP處理番茄種子過(guò)程中，處理液的pH、電導(dǎo)率（EC）和ORP的變化如圖2所示。APRTP處理5 min即可引起水的pH顯著降低，由6.42降低至4.68，處理10 min時(shí)，pH為4.31，之后隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，pH持續(xù)降低，至處理30 min時(shí)，pH只有3.54。與pH的變化相反，APRTP處理后，處理液的EC和ORP顯著升高，處理5 min時(shí)，EC和ORP分別是0 min時(shí)的24.15倍（28.55 μS/cm）和1.30倍（394.0 mV）。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)， EC值和ORP逐漸增大，至處理30 min時(shí)， EC值和ORP分別為163.15 μS/cm和459.65 mV。

2.2 APRTP處理對(duì)番茄種帶細(xì)菌的滅菌效果

APRTP處理不同時(shí)間后，番茄種子表面帶細(xì)菌情況如圖3所示，NaClO處理和APRTP處理對(duì)種子表面細(xì)菌均具有滅菌效果。隨著APRTP處理時(shí)間的延長(zhǎng)，種子表面所帶細(xì)菌數(shù)量逐漸減少，滅菌率逐漸升高（表1），處理5 min時(shí)，種子表面滅菌率為85.49%；處理20 min時(shí)，滅菌率達(dá)到99%以上，與NaClO溶液的滅菌效果相當(dāng)。

APRTP處理對(duì)番茄種子內(nèi)部細(xì)菌也有滅菌效果，與表面細(xì)菌的變化趨勢(shì)一致，處理時(shí)間越長(zhǎng)，種子內(nèi)部細(xì)菌數(shù)量減少，滅菌率升高，但相較于對(duì)種子表面所帶細(xì)菌的滅菌效率，APRTP對(duì)內(nèi)部細(xì)菌的滅菌效率較低（表1）。APRTP處理5 min時(shí)，滅菌率僅為19.08%；處理20 min時(shí)，滅菌率為50%左右；處理25 min時(shí)，滅菌率達(dá)到99.72%，與NaClO溶液的滅菌效果（99.73%）相當(dāng)。

為了更加準(zhǔn)確地測(cè)定APRTP處理對(duì)番茄種帶細(xì)菌的滅菌效果，采用16S rRNA拷貝數(shù)進(jìn)一步表征種帶細(xì)菌數(shù)量的變化情況。結(jié)果如圖4所示，APRTP處理后，16S rRNA拷貝數(shù)顯著減少，且處理時(shí)間越長(zhǎng)，拷貝數(shù)越少。對(duì)于種子表面細(xì)菌，處理時(shí)間低于10 min時(shí)，16S rRNA拷貝數(shù)仍保持在107/g數(shù)量級(jí)，滅菌率低于70%；處理15 min時(shí)，16S rRNA拷貝數(shù)降低至106/g數(shù)量級(jí)，滅菌率達(dá)到90%以上，至處理25 min時(shí)，滅菌率高達(dá)98%以上，滅菌效果與NaClO相當(dāng)（圖4a）。

番茄種子內(nèi)部細(xì)菌16S rRNA拷貝數(shù)隨APRTP處理也呈逐漸下降趨勢(shì)，但滅菌效果顯著低于種子表面細(xì)菌（圖4b）。所有處理后，16S rRNA拷貝數(shù)仍保持在106/g數(shù)量級(jí)。 處理5、10、15、20 min時(shí)滅菌率分別為10.12%、12.80%、18.23%和30.78%；處理25 min滅菌率顯著升高，達(dá)到了54.04%，與NaClO消毒處理的效果相當(dāng)（56.76%）；至處理30 min時(shí)，滅菌率達(dá)到64.07%，優(yōu)于NaClO的處理效果。

綜合細(xì)菌平板計(jì)數(shù)和16S rRNA拷貝數(shù)分析結(jié)果，APRTP處理對(duì)番茄種子表面和內(nèi)部帶細(xì)菌均具有很好的滅菌效果，在5～30 min范圍內(nèi)，隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，滅菌率逐漸升高，且處理15～25 min時(shí)，滅菌率可達(dá)到NaClO溶液的處理效果。

2.3 APRTP處理對(duì)番茄種帶Cmm菌的滅菌效果

番茄種子人工接種細(xì)菌性潰瘍病致病菌Cmm后采用APRTP處理，分別采用平板計(jì)數(shù)和Real-time PCR分子方法檢測(cè)APRTP處理對(duì)種帶Cmm菌的滅菌效率，結(jié)果如圖5所示。APRTP處理對(duì)Cmm菌的滅菌效果十分顯著，處理5 min時(shí)滅菌率即可達(dá)到60%以上，處理15 min時(shí)滅菌率大于90%，至處理25 min時(shí)，對(duì)Cmm菌的滅菌率可達(dá)99.84%。

2.4 APRTP處理對(duì)番茄種子活力的影響

由圖6可知，APRTP處理對(duì)番茄種子活力具有促進(jìn)作用，隨著APRTP處理時(shí)間的延長(zhǎng)，種子活力呈先升高后降低的趨勢(shì)，以處理15 min（P15）和20 min（P20）的種子活力最高。萌發(fā)0 h時(shí)，P15和P20種子活力分別是CK的1.58倍和1.31倍；萌發(fā)48 h時(shí)，P15和P20種子活力是CK的1.81倍和1.69倍。當(dāng)處理時(shí)間超過(guò)25 min時(shí)，種子活力略有降低，但仍高于CK。NaClO消毒處理后，番茄種子的活力較CK顯著降低。

APRTP處理后番茄種子的萌發(fā)速率顯著提高（圖7），萌發(fā)第2.5天時(shí)，CK種子的萌發(fā)率僅為13.51%，處理5、10 min的種子的萌發(fā)率顯著高于CK，分別為23.02%和28.13%，處理15～30 min種子的萌發(fā)率更高，達(dá)到55%以上；在萌發(fā)第4 天時(shí)，CK的萌發(fā)率僅為40.1%，APRTP處理后的種子萌發(fā)率均達(dá)到65%以上，處理時(shí)間超過(guò)15 min的種子，其萌發(fā)率達(dá)到75%左右，且萌發(fā)已趨于平臺(tái)期。

計(jì)算不同處理的番茄種子的發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)Gi和活力指數(shù)Vi等參數(shù)，結(jié)果如表2所示。APRTP處理后，種子的發(fā)芽率未發(fā)生顯著變化。對(duì)于種子發(fā)芽率、Gi、Vi，APRTP處理后，各項(xiàng)參數(shù)均顯著升高，尤其是處理15～20 min時(shí)，種子的上述各項(xiàng)參數(shù)最高。NaClO處理后，種子的各項(xiàng)指數(shù)與CK相比無(wú)顯著差異?？梢?jiàn)，APRTP處理可以顯著提高種子萌發(fā)速率，從而縮短萌發(fā)時(shí)間，提高萌發(fā)整齊度。

將APRTP處理的番茄種子播種于育苗基質(zhì)中，并于播種后15 d測(cè)定幼苗的形態(tài)指標(biāo)，如表3所示，APRTP處理的種子在出苗后，幼苗的株高、莖粗、地上部和地下部的鮮質(zhì)量、干質(zhì)量以及壯苗指數(shù)等與CK相比無(wú)顯著差異（P> 0.05），表明APRTP處理種子不會(huì)對(duì)番茄幼苗早期的生長(zhǎng)發(fā)育造成傷害。

3 討論

在液體環(huán)境中，APRTP發(fā)生時(shí)產(chǎn)生大量帶電粒子、活性氧化物、活性氮化物等，使液體理化性質(zhì)發(fā)生改變，導(dǎo)致液體酸化，同時(shí)產(chǎn)生NO-3、NO-2、H2O2等活性物質(zhì)和離子[14-15， 31-32]。與上述報(bào)道結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)，APRTP處理番茄種子過(guò)程中，處理液的理化性質(zhì)發(fā)生了顯著變化，pH降低，EC和ORP升高，表明通過(guò)水對(duì)番茄種子進(jìn)行APRTP處理是可行的。在傳統(tǒng)的APRTP處理作物種子時(shí)，多是將樣品放入等離子體發(fā)生裝置中直接處理，然而由于樣品形狀的不規(guī)則性，使得樣品表面的電場(chǎng)強(qiáng)度不均勻，進(jìn)而導(dǎo)致處理效果不均一[33]。本研究中，水經(jīng)APRTP處理后呈現(xiàn)較強(qiáng)的酸性和氧化性，且水的均勻性和流動(dòng)性可以使APRTP的殺菌效果更加均一[34-35]。

通過(guò)對(duì)番茄種帶細(xì)菌的培養(yǎng)計(jì)數(shù)和16S rRNA拷貝數(shù)分析發(fā)現(xiàn)，APRTP處理對(duì)番茄種子表面細(xì)菌具有顯著的滅菌效果，這與對(duì)鷹嘴豆、小麥、油菜等種子的處理效果一致[21-22， 36]。APRTP處理20 min時(shí)，對(duì)種子表面細(xì)菌的滅菌率可達(dá)99%以上，與傳統(tǒng)的NaClO消毒處理的效果相當(dāng)；此外，APRTP對(duì)番茄主要的種帶細(xì)菌性病害潰瘍病的致病菌Cmm的滅菌效果也十分顯著，表明APRTP處理可以作為一種有效的番茄種子消毒方法。分析APRTP的滅菌機(jī)理，存在以下幾個(gè)方面：首先，APRTP處理致使水酸化，改變了種子表面微生物的生存環(huán)境，引起細(xì)菌死亡。Ikawa等[37]發(fā)現(xiàn)當(dāng)水的pH小于4.7時(shí)，細(xì)菌可被有效滅活。另外，APRTP處理后產(chǎn)生的活性氧等分子可直接氧化細(xì)胞壁的主要組分肽聚糖和細(xì)胞膜的主要組分磷脂雙分子層，破壞這些分子中的C-C、C-N和C-O鍵，導(dǎo)致細(xì)胞壁和細(xì)胞膜破裂和分解，細(xì)胞通透性改變，胞內(nèi)物質(zhì)流失，細(xì)胞死亡[38]?；钚匝趸镞€可直接與細(xì)菌的蛋白質(zhì)和核酸大分子發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、DNA損傷而失活[39]。此外，APRTP發(fā)生過(guò)程中產(chǎn)生大量的帶電粒子吸附在細(xì)胞表面，同性電荷之間產(chǎn)生的靜電斥力也會(huì)破壞細(xì)菌外層的細(xì)胞壁或細(xì)胞膜，導(dǎo)致細(xì)胞死亡[14]。

本試驗(yàn)進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，APRTP處理對(duì)番茄種子內(nèi)生細(xì)菌也有顯著的滅菌效果，這在傳統(tǒng)的以氣體為媒質(zhì)進(jìn)行的APRTP種子處理中尚無(wú)報(bào)道。盡管在相同處理時(shí)間下，APRTP對(duì)種子內(nèi)生細(xì)菌的滅菌率較種子表面細(xì)菌低，處理25 min時(shí)，對(duì)種子內(nèi)生細(xì)菌的滅菌率也可達(dá)到NaClO處理的效果。分析APRTP對(duì)種子內(nèi)生細(xì)菌的滅菌原理，主要是在水中進(jìn)行APRTP種子處理時(shí)，酸性水導(dǎo)致種子表面的細(xì)胞膜透性增加，種子吸水能力增強(qiáng)[40]，帶電粒子和活性氧等活性成分可隨種子吸水進(jìn)入種子內(nèi)部，破壞內(nèi)生細(xì)菌的細(xì)胞壁、細(xì)胞膜、核酸等組分，從而殺滅細(xì)菌。

APRTP處理能顯著提高種子活力。有報(bào)道表明，APRTP處理后，大豆、小麥等種子的發(fā)芽勢(shì)顯著提高，種子發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)顯著增加[23-24]。與已有的報(bào)道結(jié)果一致，本研究發(fā)現(xiàn)，APRTP處理后番茄種子活力顯著升高，發(fā)芽勢(shì)、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)顯著增加，種子萌發(fā)和出苗時(shí)間縮短。APRTP處理提高種子活力的原因是多方面的。首先，APRTP處理后水質(zhì)酸化，酸化的環(huán)境可促進(jìn)種皮蠟質(zhì)皮層的破裂，增加種子表面膜透性，提高種子吸水性，種子內(nèi)部有關(guān)酶活性升高，儲(chǔ)藏物質(zhì)的分解代謝加快，從而提高種子活力，促進(jìn)種子萌發(fā)[32， 36， 40]。其次，APRTP產(chǎn)生的活性成分在提高種子活力中也發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)APRTP產(chǎn)生的H2O2是促進(jìn)綠豆種子萌發(fā)的一個(gè)主要因素，其促進(jìn)效果與0.01% H2O2處理效果相當(dāng)[41]。對(duì)黃瓜種子的研究發(fā)現(xiàn)，APRTP處理產(chǎn)生的臭氧可以增加種皮透性，促進(jìn)種子萌發(fā)[42]。此外，種子表面寄生的大量致病性微生物是阻礙種子萌發(fā)的主要原因之一，APRTP處理可以殺死種子表面微生物，凈化種子，從而有助于種子的萌發(fā)[43]。

APRTP處理可以顯著殺滅番茄種帶細(xì)菌，提高種子活力，縮短萌發(fā)時(shí)間，且對(duì)播種后幼苗的早期生長(zhǎng)發(fā)育不會(huì)造成傷害，為番茄種子處理提供了一種安全、高效的處理方法。APRTP處理對(duì)番茄種帶細(xì)菌的滅菌效果是否具有選擇性？對(duì)番茄的其他種帶病原菌如尖孢鐮刀菌F. oxysporum等細(xì)菌以及番茄疫霉菌Phytophthora infestans（Mont.） de Bary等真菌是否具有滅菌效果呢？APRTP處理對(duì)番茄種子活力提高的原理和物質(zhì)基礎(chǔ)是什么？對(duì)上述這些問(wèn)題的解答和探索，將是下一步工作的重點(diǎn)。

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（責(zé)任編輯：田 喆）