四川省成都市狹葉十大功勞炭疽病病原菌的鑒定與生物學(xué)特性研究

李沛利　劉丹　陳詩(shī)瑤　龔國(guó)淑

摘要

為弄清狹葉十大功勞炭疽病的病原菌，從四川省成都市采集疑似為炭疽病的病葉，采用組織分離法分離病原菌，單孢純化后通過柯赫氏法則驗(yàn)證為致病菌；根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合多基因系統(tǒng)學(xué)，將病原菌鑒定為果生炭疽菌Colletotrichum fructicola。該菌對(duì)溫度的適應(yīng)范圍較廣，10～35℃之間均能生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，最適生長(zhǎng)和產(chǎn)孢溫度均為30℃；光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢影響不顯著；在pH 3～11之間均能生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，菌絲生長(zhǎng)最適pH為7，產(chǎn)孢最適pH為4；葡萄糖、甘露醇、乳糖和麥芽糖是菌絲生長(zhǎng)的最適碳源，麥芽糖為產(chǎn)孢的最適碳源；蛋白胨是生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的最適氮源。

關(guān)鍵詞

十大功勞； 炭疽??； 病原鑒定； 生物學(xué)特性

中圖分類號(hào)：

S 432.44

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2017381

Identification and biological characteristics of the pathogen causing anthracnose onMahonia fortunei in Chengdu， Sichuan

LI Peili， LIU Dan， CHEN Shiyao， GONG Guoshu

（College of Agronomy， Sichuan Key Laboratory for Major Crop Diseases， National Demonstration Center forExperimental Crop Science Education， Sichuan Agricultural University， Chengdu 611130， China）

Abstract

In order to identify the pathogen causing anthracnose of Mahonia fortunei， small pieces of tissues were taken from the leaves which exhibited symptoms of anthracnose， and through tissue separation， singlespore purification and Kochs postulate， the pathogenic isolate was confirmed. Based on morphological characteristics and multilocus sequences， the isolate was identified as Colletotrichum fructicola. The isolate had a wide range of temperature adaptation； the temperature range for mycelium growth and sporulation was from 10℃ to 35℃ and the optimum temperature was 30℃. The light had no remarkable effect on the mycelial growth and sporulation. The pH range for mycelium growth and sporulation was from 3 to 11， and the optimum pH for mycelium growth and sporulation was 7 and 4， respectively. The optimal carbon sources for mycelial growth were dextrose， mannitol， maltobiose and lactose， and for sporulation， maltobiose. The optimal nitrogen source for mycelial growth and sporulation was peptone.

Key words

Mahonia fortunei； anthracnose； pathogen identification； biological characteristics

狹葉十大功勞Mahonia fortunei（Lindl.） Fedde，又名細(xì)葉十大功勞，為小檗科十大功勞屬M(fèi)ahonia常綠灌木[1]。狹葉十大功勞四季常綠、枝葉茂盛，廣泛應(yīng)用于道路、草坪、花壇、池畔作點(diǎn)綴，是重要的園林觀賞植物。其根、莖、葉均可入藥，有清熱燥濕、瀉火解毒、滋陰益肺、兼補(bǔ)肝腎等的功效，在治療濕疹、牛皮癬上也得到充分應(yīng)用，被譽(yù)為“綠色藥物”、“天然藥物”，可用于開發(fā)多種藥品[23]。

在四川，狹葉十大功勞市場(chǎng)需求量不斷增加，作為重要的綠化植物和藥用植物廣為種植，由于種植密度增加，病原菌積累，外界環(huán)境惡化等諸多因素的影響，狹葉十大功勞病害日益嚴(yán)重，部分病害已嚴(yán)重影響到其在醫(yī)藥和綠化事業(yè)的價(jià)值。據(jù)初步調(diào)查，四川發(fā)生嚴(yán)重的病害主要為白粉病和炭疽病，目前對(duì)狹葉十大功勞白粉病的報(bào)道較多[1，46]，而對(duì)炭疽病，國(guó)外僅見意大利有荷花炭疽菌Colletotrichum nymphaeae引起冬青葉十大功勞炭疽病的報(bào)道[7]，國(guó)內(nèi)僅在廣西有膠孢炭疽菌C. gloeosporioides引起闊葉十大功勞炭疽病的報(bào)道[8]，而狹葉十大功勞炭疽病的病原菌國(guó)內(nèi)外目前未見系統(tǒng)報(bào)道。

狹葉十大功勞炭疽病主要危害植株完全展開的葉片，受害葉片最初出現(xiàn)凹陷小斑點(diǎn)，隨后擴(kuò)展成近圓形、橢圓形或不規(guī)則形，病斑中部灰白色至灰褐色，稍微凹陷，邊緣黑褐色或暗紫色，具黃色暈圈，條件適宜時(shí)，病斑上形成許多黑色的小粒點(diǎn)（病原菌的分生孢子盤），發(fā)病嚴(yán)重時(shí)葉片枯死，影響植株的生長(zhǎng)。目前四川省狹葉十大功勞炭疽病發(fā)生范圍雖不如白粉病廣，但在局部地區(qū)危害較為嚴(yán)重，發(fā)病率可高達(dá)50%～60%。弄清病原菌的分類地位是病害防控的基礎(chǔ)。而生物學(xué)特性在一定程度上反映了病原菌生長(zhǎng)所需的條件，通過了解病原菌生長(zhǎng)的條件，可根據(jù)環(huán)境條件，預(yù)測(cè)病害發(fā)生的情況，適時(shí)用藥，減輕病害的發(fā)生發(fā)展。本研究對(duì)狹葉十大功勞炭疽病進(jìn)行了病原鑒定和生物學(xué)特性研究，旨在弄清病原，掌握發(fā)病規(guī)律，從而為病害的防控提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

2015年9月，從四川省成都市采集疑似感染炭疽病的新鮮狹葉十大功勞病葉，一部分用于顯微鑒定，一部分用于分離。

1.2 顯微鑒定

選取疑似為炭疽病的新鮮狹葉十大功勞病葉，徒手切片后在顯微鏡下觀察。

1.3 病原菌的分離與純化

病原菌的分離采用常規(guī)的組織分離法[9]，經(jīng)分離培養(yǎng)得到的菌株單孢純化后于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 致病性測(cè)定

將保存的菌株在PDA培養(yǎng)基上活化后，接種于馬鈴薯葡萄糖瓊脂（PDA）培養(yǎng)基平板上，25℃培養(yǎng)7 d，洗下分生孢子，配制成濃度約為107個(gè)/mL的孢子懸浮液，用毛筆刷于健康的一年生狹葉十大功勞葉片表面。清洗除去表面的灰塵，再用75%的酒精棉球擦拭，無(wú)菌水清洗后自然晾干，設(shè)置穿刺與無(wú)傷兩個(gè)處理，均以刷無(wú)菌水的葉片為對(duì)照，每處理接種10片葉，重復(fù)3次?；亟雍蟮娜~片置于25℃光照培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)，每天觀察發(fā)病情況。若接種葉片發(fā)病則取發(fā)病部位重新分離，完成柯赫氏法則驗(yàn)證。

1.5 病原菌的鑒定

1.5.1 形態(tài)學(xué)鑒定

將病原菌移接于PDA平板上，25℃光暗交替（12 h光照，12 h黑暗）條件下培養(yǎng)，觀察和記錄菌落形態(tài)和顏色。待病原菌產(chǎn)孢后，制成玻片觀察分生孢子的形態(tài)，隨機(jī)測(cè)量100個(gè)孢子的大小。采用玻片萌發(fā)法觀察附著胞的形態(tài)，分生孢子附著胞的萌發(fā)參考Yang等[10]，菌絲附著胞的萌發(fā)參考Cai等[11]，分別在24 h和7 d后觀察附著胞形成情況，各隨機(jī)選取50個(gè)測(cè)量大小。

1.5.2 病原菌的多基因系統(tǒng)學(xué)鑒定

收集供試菌株的菌絲，采用生工生物工程股份有限公司（生工）研制的Ezup柱式真菌基因組DNA抽提試劑盒提取病原菌DNA。參照Weir等人[12]的方法，由生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成核糖體內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer， ITS）、肌動(dòng)蛋白基因（actin gene， ACT）、3磷酸甘油醛脫氫酶基因（glyceraldehyde3phosphate dehydrogenase gene，GAPDH）、幾丁質(zhì)合成酶A基因（chitin synthase A gene，CHS1）、β微管蛋白基因（βtubulin gene，TUB2）和鈣調(diào)蛋白基因（calmodulin gene，CAL）6對(duì)引物，反應(yīng)體系及條件參照李沛利等[13]。

將獲得的PCR產(chǎn)物送至生工生物工程科技服務(wù)有限公司測(cè)序，將所得各個(gè)基因序列與GenBank中的序列進(jìn)行比對(duì)，并結(jié)合測(cè)序峰圖進(jìn)行必要手動(dòng)修改。下載相似性高的序列及其對(duì)應(yīng)復(fù)合種常見模式菌的序列（表1），使用ClustalX2.0.10軟件進(jìn)行剪切，按ITSACTGAPDHCHS1TUB2CAL的順序相連，以C. karstii（CORCG6）為外群，通過PAUP v4.0b10軟件以最大簡(jiǎn)約法（MP）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6 病原菌生物學(xué)特性研究

采用平板測(cè)定法。將供試菌株在PDA培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)5 d，用打孔器（d=5 mm）在菌落外緣相同半徑的圓周上打孔，制成菌絲圓片待用。生物學(xué)特性測(cè)定所用平板直徑均為9 cm，每處理均重復(fù)3次。

1.6.1 不同溫度、光照、pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

取菌絲圓片于自然pH的PDA培養(yǎng)基平板中央，分別置于0、5、10、15、20、25、30、35和40℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，測(cè)定不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響；置于光照、光暗交替、黑暗的25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，測(cè)定不同光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響。取菌絲圓片于不同pH（3、4、5、6、7、8、9、10、11）的PDA培養(yǎng)基平板中央，置于25℃培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，測(cè)定不同pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響。均用十字交叉法測(cè)定菌落直徑，15 d后每皿平板中加入10 mL無(wú)菌水，將孢子充分洗下，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.6.2 不同碳、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

以不加蔗糖的查氏培養(yǎng)基[14]為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入與蔗糖等量的甘露醇、乳糖、麥芽糖、淀粉、果糖、葡萄糖和蔗糖，配制成不同的培養(yǎng)基，以不加碳源的查氏培養(yǎng)基為對(duì)照（CK）。以不加硝酸鈉的查氏培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別加入與硝酸鈉等量的尿素、草氨酸、硫酸銨、硝酸鉀、氯化銨、甘氨酸、蛋白胨和硝酸鈉，配制成不同的培養(yǎng)基，以不加氮源的查氏培養(yǎng)基為對(duì)照（CK）。取菌絲圓片分別接于培養(yǎng)基平板中央，置于25℃恒溫培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)，按照1.6.1的方法測(cè)定菌落直徑和計(jì)算產(chǎn)孢量。

1.6.3 數(shù)據(jù)分析

通過SPSS 20.0軟件，采用Duncan氏新復(fù)極差法[14]對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（P=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯微鑒定

病部切片后，可觀察到分生孢子盤半埋生在寄主組織下，具黑褐色剛毛，分生孢子單孢，圓柱形（圖1）。

2.2 菌株的分離培養(yǎng)

經(jīng)分離培養(yǎng)得到的菌株菌落形態(tài)基本一致，將單孢純化后得到代表菌株命名為SDGL3用于進(jìn)一步測(cè)定。

2.3 病原菌的致病性

將SDGL3的孢子懸浮液回接到健康的十大功勞葉片上7 d后，穿刺接種的狹葉十大功勞葉片全部發(fā)?。▓D2），癥狀與田間觀察到的相似（圖3），對(duì)照和無(wú)傷接種的處理不發(fā)病；用發(fā)病的病斑進(jìn)行常規(guī)分離，再次獲得與原分離菌一致的病原菌，根據(jù)柯赫氏法則，證明接種菌即為狹葉十大功勞炭疽病的病原菌。

2.4 病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定

在PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)，菌落正面菌絲稠密，棉絮狀，初為白色后轉(zhuǎn)為灰白色或鼠灰色（圖4a），背面為黃褐色，略帶輪紋（圖4b），菌絲生長(zhǎng)速率為12.6 mm/d，培養(yǎng)第7天菌落中央伴有粉紅色孢子堆產(chǎn)生。分生孢子無(wú)色，單胞，長(zhǎng)橢圓形，兩端鈍圓，具1～2個(gè)油球（圖4c），隨機(jī)選取100個(gè)分生孢子進(jìn)行測(cè)量，得其大小為（8.8～16.0）μm×（3.1～5.6）μm（平均12.7 μm×4.6 μm，n=100）。分生孢子附著胞橢圓形、棒形或不規(guī)則形（圖5），大小為（6.7～15.2）μm×（5.2～8.2）μm （平均10.3 μm×6.5 μm，n=50）。菌絲附著胞圓形、卵形、棒形或不規(guī)則形（圖6），大小為（5.0～14.2）μm×（4.4～8.9）μm，（平均10.1 μm×6.4 μm，n=50）。根據(jù)病原菌的形態(tài)特征，結(jié)合Weir等人[12]的描述，初步確定狹葉十大功勞炭疽病的病原菌SDGL3屬于膠孢炭疽復(fù)合種（C.gloeosporioides species complex）。

2.5 病原菌的多基因系統(tǒng)學(xué)鑒定

構(gòu)建的多基因系統(tǒng)發(fā)育樹樹長(zhǎng)TL=857，一致性指數(shù)CI=0.833 1，保留指數(shù)RI=0.798 3，校正一致性指數(shù)RC=0.665 1，從發(fā)育樹上（圖7）可以看出，SDGL3菌株與果生炭疽菌C.fructicola聚在一起，形成一個(gè)明顯的分支，而其他種的炭疽菌也各自聚在一起形成明顯的分支，并且每個(gè)分支之間都有較高的支持率，因此，確定狹葉十大功勞炭疽病的病原菌為果生炭疽菌C.fructicola Prihastuti，L.Cai & K.D.Hyde。

2.6 病原菌生物學(xué)特性研究

2.6.1 不同溫度、光照、pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

SDGL3對(duì)溫度的適應(yīng)范圍較廣，在溫度10～35℃之間均能生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，最適生長(zhǎng)和產(chǎn)孢溫度均為30℃。光照對(duì)SDGL3的菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢無(wú)明顯影響，但對(duì)菌落顏色有影響，菌落在光照條件下為白色，光暗交替條件下為鼠灰色，黑暗條件下為墨綠色。SDGL3對(duì)pH的適應(yīng)范圍較廣，菌絲在pH為3～11之間均能生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，菌絲生長(zhǎng)最適pH為7，產(chǎn)孢最適pH為4（圖8）。

2.6.2 不同碳、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響

SDGL3在供試的8種培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，在葡萄糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖為碳源的培養(yǎng)基中菌絲生長(zhǎng)較快，在不加碳源的CK中菌絲生長(zhǎng)最慢且菌絲非常稀疏，但菌落大小與在果糖、淀粉、蔗糖為碳源的培養(yǎng)基中差異不顯著。在碳源為麥芽糖時(shí)產(chǎn)孢最多，極顯著高于其他碳源，在未加碳源的CK中產(chǎn)孢最差，極顯著低于其他碳源。SDGL3在供試的9種不同氮源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，在以蛋白胨為氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最快，產(chǎn)孢最多，極顯著高于其他氮源。在尿素為氮源的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)最慢，產(chǎn)孢也最少。在不加氮源的CK中菌絲生長(zhǎng)較快，僅次于氮源為蛋白胨和甘氨酸時(shí)，但菌絲非常稀疏，產(chǎn)孢量少，與氮源為尿素、草氨酸時(shí)差異不顯著，極顯著低于其他氮源（圖8）。

3 結(jié)論與討論

本文將引起狹葉十大功勞炭疽病的病原菌鑒定為果生炭疽菌C. fructicola，研究結(jié)果與同屬的冬青葉十大功勞和闊葉十大功勞炭疽病的病原不盡相同[78]。究其原因，一方面可能是由于一種寄主植物本身可被多種炭疽菌所侵染，如鵝掌柴可被喀斯特炭疽菌C. karstii和暹羅炭疽菌C. siamense所侵染[13]，芒果可被亞洲炭疽菌C. asianum、果生炭疽菌C. fructicola和喀斯特炭疽菌C. karstii等5種炭疽菌所侵染[15]，辣椒可被膠孢炭疽菌C. gloeosporioides、暹羅炭疽菌C. siamense、 果生炭疽菌C. fructicola等 7種炭疽菌侵染[16]。另一方面，果生炭疽菌C.fructicola所屬的膠孢炭疽復(fù)合種C.gloeosporioides species complex，在形態(tài)鑒定的基礎(chǔ)上，需選用多基因聯(lián)合進(jìn)行鑒定，才能準(zhǔn)確鑒定到種，譚海文等[8]只用了ITS序列進(jìn)行了鑒定，該序列不能很好地區(qū)分膠孢炭疽復(fù)合種（C.gloeosporioides species complex）里面的近緣種[12]，因此得出的結(jié)果還需選用其他引物進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。本文采用組織分離法分離病原菌，單孢純化后通過柯赫氏法則驗(yàn)證為致病菌；根據(jù)形態(tài)學(xué)特征，結(jié)合ITS、ACT、GAPDH、CHS1、TUB2和CAL進(jìn)行多基因系統(tǒng)學(xué)分析，結(jié)果應(yīng)該是準(zhǔn)確可靠的，這是關(guān)于果生炭疽菌C. fructicola引起狹葉十大功勞炭疽病的首次報(bào)道，病原的確定為狹葉十大功勞炭疽病的診斷和防治提供了一定的理論依據(jù)。但狹葉十大功勞炭疽病的病原菌是否還有其他種類，則還有待于通過擴(kuò)大采樣范圍，增加采樣數(shù)量進(jìn)一步確定。

果生炭疽菌C. fructicola在泰國(guó)的咖啡漿果上發(fā)現(xiàn)后[17]，相繼在全球多種寄主植物上被發(fā)現(xiàn)，被證明具有廣泛的寄主范圍和地理分布[18]，不同寄主和地理來(lái)源的病原菌生活習(xí)性可能會(huì)有所不同，本文較為系統(tǒng)地研究了溫度、光照、pH、碳源、氮源等不同條件對(duì)狹葉十大功勞炭疽菌SDGL3菌絲生長(zhǎng)、孢子產(chǎn)生的影響，結(jié)果表明，SDGL3在10～35℃條件下均能生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，最適合菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的溫度為30℃，這與狹葉十大功勞炭疽病8-9月為發(fā)病高峰相符；不同的光照條件對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢影響差異不顯著，這可能是因?yàn)楠M葉十大功勞喜陰，常栽種于大樹下，所以病原菌對(duì)光不敏感；病原菌菌絲生長(zhǎng)最適pH為7，產(chǎn)孢最適pH為4，說明病原菌孢子嗜酸，這可能與狹葉十大功勞喜排水良好的酸性腐殖土有關(guān)；不加碳源的CK菌絲生長(zhǎng)最慢，產(chǎn)孢最差，說明碳源在SDGL3菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢中起著重要作用。不加氮源的CK菌絲生長(zhǎng)較快，產(chǎn)孢較少，說明氮源主要影響產(chǎn)孢。目前關(guān)于果生炭疽菌C. fructicola生物學(xué)特性的報(bào)道不多，僅見劉倩麗等人[19] 對(duì)引起檀香炭疽病的果生炭疽菌C. fructicola菌絲生長(zhǎng)和孢子萌發(fā)的條件進(jìn)行了研究，對(duì)比菌絲生長(zhǎng)條件發(fā)現(xiàn)：兩菌對(duì)溫度、光照、pH、營(yíng)養(yǎng)條件都有較好的適應(yīng)性，最適溫度一致，但最適光照、pH、碳源、氮源都有差異，這種差異可能與菌株在不同種類植物上寄生或者變異有關(guān)[20]。本研究明確了引起十大功勞炭疽病的果生炭疽菌C. fructicola菌絲生長(zhǎng)及孢子產(chǎn)生的最適條件，為掌握病害發(fā)生發(fā)展規(guī)律，從而防治狹葉十大功勞炭疽病奠定了基礎(chǔ)。

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（責(zé)任編輯：田 喆）