適合Pilidium lythri菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的培養(yǎng)基

張桂軍　郭巍　畢揚(yáng)　楊寶東　張偉　宗召莉

摘要

由Pilidium lythri引起的草莓褐色葉斑病是在草莓Fragaria×ananassa上發(fā)現(xiàn)的一種新病害。病原菌在PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂）培養(yǎng)基上生長(zhǎng)速度慢，產(chǎn)孢量低。為了探討不同培養(yǎng)基對(duì)P.lythri菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響，篩選適合該病原菌菌絲生長(zhǎng)和大量產(chǎn)孢的培養(yǎng)基，本文比較了10種培養(yǎng)基對(duì)P.lythri生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響，結(jié)果表明，SPDA（添加1.2%草莓果汁的馬鈴薯葡萄糖瓊脂）培養(yǎng)基可以促進(jìn)P.lythri菌絲生長(zhǎng)；CA（胡蘿卜瓊脂）培養(yǎng)基、V8培養(yǎng)基和TPDA（胰蛋白胨馬鈴薯葡萄糖瓊脂）培養(yǎng)基則可以促進(jìn)P.lythri大量產(chǎn)生分生孢子。

關(guān)鍵詞

草莓褐色葉斑?。?Pilidium lythri； 培養(yǎng)基； 菌絲生長(zhǎng)； 產(chǎn)孢

中圖分類號(hào)：

S 436.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2018090

The culture medium suit for mycelial growth and spore

production of Pilidium lythri

ZHANG Guijun， GUO Wei， BI Yang， YANG Baodong， ZHANG Wei， ZONG Zhaoli

（Beijing Key Laboratory of New Technology in Agricultural Application， National Demonstration Center for

Experimental Plant Production Education，Beijing University of Agriculture， Beijing 102206， China）

Abstract

Pilidium lythri tanbrown leaf spot of strawberry was a new disease in China. In previous studies， the widely used PDA medium had low mycelial growth rate and low yield of spores.In order to select the optimal medium for P.lythri，the effects of ten culture media that based on PDA medium on the mycelial growth and sporulation of P.lythri were compared. The results showed that SPDA （strawberry potato dextrose agar） medium can promote P.lythri mycelial growth， CA （carrot agar） medium， V8 medium and TPDA （tryptone） medium can promote P.lythri to produce conidia in large quantities.

Key words

tanbrown leaf spot of strawberry； Pilidium lythri； medium； mycelial growth； spore production

Pilidium lythri是國(guó)內(nèi)外報(bào)道危害草莓的又一種病原真菌[1]。該病原菌首次在日本發(fā)現(xiàn)危害草莓，之后在波蘭、巴西、比利時(shí)、美國(guó)和伊朗等地也有報(bào)道[26]，國(guó)內(nèi)目前僅在北京地區(qū)發(fā)現(xiàn)該病菌危害草莓[7]。該病害發(fā)病初期在葉片中央或邊緣形成圓形、水浸狀、褐色病斑，后期病斑逐漸擴(kuò)大，褐色至黑褐色，中間灰白色，邊緣淡褐色，潮濕條件下病部產(chǎn)生橘紅色團(tuán)狀黏質(zhì)小點(diǎn)。果實(shí)癥狀初期為淺褐色腐爛，后期可導(dǎo)致全果腐爛，腐爛部位產(chǎn)生紅色團(tuán)狀黏質(zhì)顆粒狀物[8]。

除草莓外，P.lythri還可侵染油橄欖Olea europaea[9]、虎杖Fallopia japonica[10]、草甸水蘭Hieracium caespitosum[11]、厚葉巖白菜Bergenia crassifolia[12]、牡丹Paeonia suffruticosa[13]、桉樹Eucalyptus sp.[14]、玫瑰Rosa rugosa[15]、歐洲李Prunus domestica[16]、芍藥Paeonia lactiflora[17]等，造成黃褐色、深褐色相間的同心輪紋，天氣潮濕時(shí)，病部可見橙紅色或紅褐色的小顆粒[17]。目前，關(guān)于P.lythri的生物學(xué)特性研究較多，主要采用PDA培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)，但一般需要培養(yǎng)7 d菌落直徑才能達(dá)到5 cm左右，而且產(chǎn)孢量較少，存在P.lythri生長(zhǎng)速度慢、孢子產(chǎn)量不夠用于開展相關(guān)研究等問題。針對(duì)上述問題，本研究采用了10種真菌培養(yǎng)基進(jìn)行研究，旨在探索更適于P.lythri病菌菌絲生長(zhǎng)和大量產(chǎn)孢的培養(yǎng)基，為后續(xù)該病菌的生物學(xué)特性、致病機(jī)制等研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

分別于2015年和2017年從北京市昌平區(qū)小湯山、湖南省婁底市和山東省諸城市采集草莓病葉，經(jīng)常規(guī)組織分離、單孢純化[18]，獲得的病原菌純培養(yǎng)物，編號(hào)分別為BJ4、HNLD7、HNLD12、SD176和SD1710。菌株ITS序列的測(cè)序工作由北京六合華大基因科技有限公司完成，將測(cè)序結(jié)果在NCBI上進(jìn)行序列比對(duì)，并結(jié)合病原菌形態(tài)學(xué)觀察、柯赫氏法則驗(yàn)證后確定為草莓褐色葉斑病菌P.lythri，保存于北京農(nóng)學(xué)院植物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室。

1.2 供試培養(yǎng)基

PDA培養(yǎng)基： 將200 g去皮的馬鈴薯切塊，煮30 min至軟爛，4層紗布過濾后，加入20 g葡萄糖和20 g瓊脂粉定容于1 L水中，于121℃高壓濕熱滅菌20 min。

YDA培養(yǎng)基：酵母粉5 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉20 g，定容于1 L水中，于121℃高壓濕熱滅菌20 min。

SPDA培養(yǎng)基：將200 g去皮的馬鈴薯切塊，煮30 min至軟爛，4層紗布過濾后，加入20 g葡萄糖，20 g瓊脂粉，加入120 mL鮮榨草莓汁定容于1 L水中，于121℃高壓濕熱滅菌20 min。

YPDA培養(yǎng)基： 將200 g去皮的馬鈴薯切塊，煮30 min至軟爛，4層紗布過濾后，加入20 g葡萄糖，20 g瓊脂粉，5 g酵母粉定容于1 L水中，于121℃高壓濕熱滅菌20 min。

CPDA培養(yǎng)基：將200 g馬鈴薯同100 g胡蘿卜去皮、切塊，煮30 min至軟爛，4層紗布過濾后，加入20 g葡萄糖，20 g瓊脂粉定容于1 L水中，于121℃高壓濕熱滅菌20 min。

CA培養(yǎng)基：200 g胡蘿卜榨汁后過濾，加入20 g瓊脂定容于1 L水中，于121℃高壓濕熱滅菌20 min。

TPDA培養(yǎng)基：將200 g馬鈴薯去皮、切塊，煮30 min至軟爛，4層紗布過濾后，加入20 g葡萄糖，20 g瓊脂粉，2 g胰蛋白胨定容于1 L水中，于121℃高壓濕熱滅菌20 min。

2P2DA培養(yǎng)基：將400 g馬鈴薯去皮、切塊，煮30 min至軟爛，4層紗布過濾后，加入40 g葡萄糖，20 g瓊脂粉，2 g胰蛋白胨定容于1 L水中，于121℃高壓濕熱滅菌20 min。

P2DA培養(yǎng)基：將200 g馬鈴薯去皮、切塊，煮30 min至軟爛，4層紗布過濾后，加入40 g葡萄糖，20 g瓊脂粉定容于1 L水中，于121℃高壓濕熱滅菌20 min。

V8培養(yǎng)基：V8蔬菜汁200 mL，加碳酸鈣3 g，瓊脂粉20 g定容于1 L水中，于121℃高壓濕熱滅菌20 min。

1.3 不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)影響測(cè)定

1.3.1 菌絲生長(zhǎng)速率的測(cè)定

打取直徑5 mm的草莓褐色葉斑病菌菌餅，分別接種于PDA、YDA、SPDA、YPDA、CPDA、CA、TPDA、2P2DA、P2DA和V8培養(yǎng)基上，25℃黑暗培養(yǎng)7 d，采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，數(shù)據(jù)采用SPSS軟件中的最小顯著差異法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。每菌株每種培養(yǎng)基3次重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)2次。

1.3.2 菌絲干重的測(cè)定

選擇1.3.1中菌絲生長(zhǎng)量較大的培養(yǎng)基配方進(jìn)行菌絲干重的測(cè)定。在不同培養(yǎng)基平板表面鋪放滅菌玻璃紙，接種菌餅后于25℃黑暗培養(yǎng)7 d，刮取菌絲，烘干，測(cè)量菌絲干重，數(shù)據(jù)采用SPSS軟件中的最小顯著差異法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.4 不同培養(yǎng)基對(duì)病原菌產(chǎn)孢量影響測(cè)定

打取直徑5 mm的草莓褐色葉斑病菌菌餅，分別接種于PDA、YDA、SPDA、YPDA、CPDA、CA、TPDA、2P2DA、P2DA和V8培養(yǎng)基的平板上，25℃黑暗培養(yǎng)8 d。采用直徑5 mm的打孔器分別從上述培養(yǎng)平板中心接菌處向外依次輻射狀打取一定數(shù)量的菌餅，并記錄打取的菌餅數(shù)，置于加有10 mL無菌水（添加0.1%吐溫20）的離心管中，加入5～8粒滅菌玻璃珠，振蕩2 min洗脫孢子，用血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子數(shù)，每處理重復(fù)3次，計(jì)算每平方厘米的孢子數(shù)量，并采用SPSS軟件中的最小顯著差異法進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，試驗(yàn)重復(fù)2次。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)速率的影響

草莓褐色葉斑病病菌BJ4、HNLD7、HNLD12、SD176和SD1710在PDA、YDA、SPDA等培養(yǎng)基上，于25℃恒溫條件下培養(yǎng)，7 d后測(cè)定菌落直徑，結(jié)果表明，5株供試菌株在SPDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，其菌絲生長(zhǎng)速率最大，為0.87 cm/d，其次在P2DA、CPDA、TPDA、2P2DA和CA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)也較快，V8和YDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較慢，其中以在V8培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢，菌絲生長(zhǎng)速率最小，為0.63 cm/d（表1）。

2.2 不同培養(yǎng)基對(duì)菌落生長(zhǎng)形態(tài)的影響

如圖1～圖5所示，5株供試菌株在PDA、YDA、SPDA、TPDA和V8培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落厚實(shí)，菌絲濃密，邊緣整齊，尤其是在SPDA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)快，2～3 d即可形成肉眼看見的菌落，中央菌絲茂密、隆起；供試菌株雖然在YPDA、CPDA、CA、2P2DA 和P2DA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)也較快，但是在YPDA、CPDA、CA和2P2DA培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)稀疏；在P2DA培養(yǎng)基上雖然菌落呈圓形，邊緣整齊，但幾乎沒有菌絲。

2.3 不同培養(yǎng)基對(duì)菌絲干重的影響

選擇上述菌株培養(yǎng)性狀較好的PDA、YDA、SPDA、TPDA和V8培養(yǎng)基進(jìn)行菌絲干重的測(cè)定，結(jié)果如表2所示，供試菌株經(jīng)SPDA培養(yǎng)基培養(yǎng)后收集到的菌絲量最多，菌絲干重最大，為145.5 mg，其次為TPDA培養(yǎng)基，5株供試菌株在V8培養(yǎng)基上生長(zhǎng)后獲得的菌絲量最少，僅為12.1 mg。結(jié)合不同培養(yǎng)基對(duì)草莓褐色葉斑病菌菌絲生長(zhǎng)情況以及菌絲干重的影響，結(jié)果表明，SPDA培養(yǎng)基在菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲厚度及菌絲干重方面均為供試培養(yǎng)基中最適合供試菌株BJ4、HNLD7、HNLD12、SD176和SD1710生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。

2.4 不同培養(yǎng)基對(duì)產(chǎn)孢量的影響

將5株供試菌株接種于不同培養(yǎng)基平板上，培養(yǎng)8 d后測(cè)定產(chǎn)孢量，結(jié)果如表3所示，不同菌株其最適于產(chǎn)孢的培養(yǎng)基存在差異。CA培養(yǎng)基適于供試菌株BJ4產(chǎn)孢，產(chǎn)孢量為39.89×104個(gè)/cm2；TPDA為供試培養(yǎng)基中菌株SD176和SD1710單位面積產(chǎn)孢量最高的培養(yǎng)基，產(chǎn)孢量最大為9.32×104個(gè)/cm2；菌株HNLD7和HNLD12在V8培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢最多，產(chǎn)孢量最大為21.12×104個(gè)/cm2。所有供試菌株在PDA和YDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢最少，產(chǎn)孢量最少僅為0.28×104個(gè)/cm2。

3 討論

2012年在北京市昌平區(qū)興壽鎮(zhèn)日光溫室中首次發(fā)現(xiàn)的由Pilidium lythri引起的草莓褐色葉斑病是在草莓上發(fā)現(xiàn)的一種新病害[7]。草莓褐色葉斑病菌P.lythri為絲分孢子真菌，主要危害草莓的下部葉片，也可引起果實(shí)腐爛。目前，關(guān)于P.lythri的生物學(xué)特性研究較多，Zhang等[19]首先報(bào)道了P.lythri在河南洛陽(yáng)可以侵染牡丹，引起牡丹紅點(diǎn)病，并對(duì)該病的癥狀、病原菌特征及其生物學(xué)特性等做了比較詳細(xì)的描述。已有的研究是采用PDA培養(yǎng)基對(duì)P.lythri進(jìn)行培養(yǎng)[20]，但其一般需要培養(yǎng)7 d才能長(zhǎng)至5 cm左右，而且產(chǎn)孢量較少，存在P.lythri生長(zhǎng)速度慢、孢子產(chǎn)量不夠開展相關(guān)研究所用的問題。

本試驗(yàn)以采自北京市昌平區(qū)小湯山、湖南省婁底市和山東省諸城市的P.lythri菌株BJ4、HNLD7、HNLD12、SD176和SD1710為供試菌株，分別測(cè)定了PDA、YDA、SPDA、YPDA、CPDA、CA、TPDA、2P2DA、P2DA和V8培養(yǎng)基對(duì)5株供試菌株菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響。通過對(duì)多種培養(yǎng)基的篩選發(fā)現(xiàn)，在菌絲生長(zhǎng)速度、菌絲厚度及菌絲干重方面SPDA均為供試培養(yǎng)基中最適合所有供試菌株生長(zhǎng)的培養(yǎng)基，7 d后菌落直徑可達(dá)6.09 cm，大于文獻(xiàn)報(bào)道的PDA培養(yǎng)基上的菌落直徑（4.80 cm）[20]，菌絲干重是常用PDA培養(yǎng)基的4倍。該培養(yǎng)基在配制過程中方便、簡(jiǎn)單，可以較好地促進(jìn)草莓褐色葉斑病菌P.lythri菌絲生長(zhǎng)，提高菌絲量，極大地改善了傳統(tǒng)培養(yǎng)中使用PDA培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)的生長(zhǎng)慢，菌絲偏少的缺點(diǎn)，可實(shí)現(xiàn)P.lythri的快速培養(yǎng)，且產(chǎn)生的大量菌絲提高了該病菌分子生物學(xué)相關(guān)研究的工作效率。

段亞冰等報(bào)道，最有利于P.lythri菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢的碳源為葡萄糖，氮源為酵母膏，最適溫度是25～30℃，在pH6～11范圍內(nèi)該菌均能生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢無顯著影響[20]。本試驗(yàn)采用25℃黑暗培養(yǎng)，通過對(duì)供試菌株在不同培養(yǎng)基上的產(chǎn)孢量測(cè)定發(fā)現(xiàn)，經(jīng)pH處于中性的CA、V8和添加有胰蛋白胨的TPDA培養(yǎng)基培養(yǎng)的5株供試菌株的平均產(chǎn)孢量分別為11.43×104個(gè)/cm2、57.23×104個(gè)/cm2和8.76×104個(gè)/cm2，要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于添加酵母的YDA（產(chǎn)孢量為1.25×104個(gè)/cm2）和YPDA培養(yǎng)基（產(chǎn)孢量為2.55×104個(gè)/cm2），因此我們推測(cè)P.lythri的菌絲生長(zhǎng)及產(chǎn)孢更需要碳源。此外，本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，不同菌株其最適產(chǎn)孢的培養(yǎng)基也存在差異，采自北京的P.lythri菌株BJ4在CA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量最大；TPDA培養(yǎng)基最適于采自山東的菌株SD176和SD1710產(chǎn)孢；V8培養(yǎng)基則適于采自湖南的菌株HNLD7和HNLD12產(chǎn)孢。而所有的供試菌株在PDA和YDA培養(yǎng)基上產(chǎn)孢量是最少的。因此，CA、V8和TPDA培養(yǎng)基可用于促進(jìn)P.lythri的大量產(chǎn)孢，為該病菌的后續(xù)研究提供材料。

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（責(zé)任編輯：田 喆）