樹錦雞兒枯枝病病原菌的分離鑒定

周儀 刁辰 賈含琪 劉忠玄 董愛榮 劉雪峰

摘 要：樹錦雞兒枯枝?。–aragana arborescens （Amm.） Lam. branch blight）是在樹錦雞兒枝干上發(fā)現(xiàn)的一種新病害，在自然條件下于老齡樹枝上多發(fā)，產(chǎn)生橙黃色子實體并導(dǎo)致枝條枯死。為明確該病害的病原菌，了解其發(fā)生和侵染，本文根據(jù)柯赫氏證病法，對該病害進(jìn)行分離、接種和再分離確定病原菌，結(jié)合形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)對病原菌進(jìn)行鑒定。研究結(jié)果表明：在室內(nèi)用燒傷、劃傷和無傷3種方法接種健康3 ～ 5 a生水培枝條，30 d后僅燒傷接種表現(xiàn)出典型癥狀，說明該病原菌不能從寄主的自然孔口或直接穿透表皮入侵，屬于一種弱寄生病害。經(jīng)形態(tài)學(xué)特征比對和rDNA-ITS序列分析將引起該病害的病原菌鑒定為樹錦雞子座叢赤殼菌（Stromatonectria caraganae （H?hn.） Jaklitsch & Voglmayr. ）。

關(guān)鍵詞：樹錦雞兒枯枝病;病原鑒定;樹錦雞子座叢赤殼菌

中圖分類號：S763.15;949.32 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1006-8023（2018）06- 0007-06

Isolation and Identification of the Pathogen of Caragana arborescens

（Amm.） Lam. Branch Blight

ZHOU Yi1， DIAO Chen2， JIA Hanqi1， LIU Zhongxuan1， DONG Airong1， LIU Xuefeng1*

（1.College of Forestry， Northeast Forestry University， Harbin 150040; 2.Forestry Bureau of Xinbin County， Fushun 113200）

Abstract：Caragana arborescens （Amm.） Lam. branch blight is a new disease which was found firstly on the branches of C. arborescens in Harbin， Heilongjiang province. Under natural conditions， this disease occurs on relatively old branches， producing bright orange sporophores and then causing the branches to die. The occurrence and the invasion progress of the disease was investigated and the pathogen was identified through isolation， inoculation and re-isolation with Kochs postulates. The species of the pathogen were identified basing on morphological and molecular characteristics. In laboratory， burning， scratching and original ones were used to inoculating 3-5 years old healthily-growing hydroponics branches. After 30 days， only the burnt inoculation showed typical symptoms. The result of pathogenicity test shows that the disease cant penetrate through the natural orifice of the host and invade directly， therefore it is a weak parasitic disease. By the research on morphologic properties and rDNA-ITS sequences of the isolated strain， the pathogen of C. arborescens branch blight was identified as Stromatonectria caraganae （H?hn.） Jaklitsch & Voglmayr.

Keywords：Branch blight of Caragana arborescens （Amm.） Lam.;pathogens identification;Stromatonectria caraganae

0 引言

樹錦雞兒（Caragana arborescens （Amm.）Lam.）是豆科錦雞兒屬植物，為小喬木或大灌木。主要分布在我國的東北以及山東、河北和陜西等地區(qū)。由于該樹種具有較強的抗寒性，早春萌芽力強，且葉形優(yōu)美，所以目前在城市園林中備受關(guān)注[1]。大量的相關(guān)研究表明[2-4]樹錦雞兒具有良好的抗逆性，在防風(fēng)固沙方面表現(xiàn)良好，因此在很多地區(qū)都作為恢復(fù)植被的優(yōu)先樹種。由于該樹種抗病性良好，多年來人們的研究多集中于樹錦雞兒的抗性及繁殖，主要在葉部病害，對于其病害方面研究較少。閻科技對同為錦雞兒屬植物中檸條的常見病害及預(yù)防進(jìn)行過報道[5]，包括檸條葉銹病、花棒白粉病、煤污病和檸條葉枯病;2006年張如力等報道了除錦雞兒叉絲殼（Microsphaera caraganae）[6]和長絲叉絲殼（M. longissima）[7]外第三種寄生在錦雞兒上的白粉菌——錦雞兒束絲殼（Trichocladia sp.）。國外對于樹錦雞兒病害研究最多的是白粉病及病毒病。1964年，在華沙第一次在樹錦雞兒葉片上發(fā)現(xiàn)病毒病。到2010年Kochman等對該病毒病進(jìn)行系統(tǒng)的描述[8]。在北美洲及加拿大等地區(qū)，樹錦雞兒被認(rèn)為是一種帶有入侵性的外來灌木。在2002年7月分別在莫斯科和普爾曼邊境的樹錦雞兒上發(fā)現(xiàn)有白粉病的發(fā)生。至2009年7月病原菌帕氏叉絲殼（Microsphaera palczewskii Jacz. ）引起的白粉病，先后在北美加利福尼亞州、阿拉斯加州、北達(dá)科他州、明尼蘇達(dá)州、威斯康星州和魁北克市的樹錦雞兒上被發(fā)現(xiàn)，但均無大規(guī)模發(fā)病的報道[9-12]。

2017年，在黑龍江省哈爾濱市東北林業(yè)大學(xué)校園中發(fā)現(xiàn)有樹錦雞兒枯枝病的發(fā)生，其病部產(chǎn)生鮮艷的橙黃色子實體，經(jīng)查閱國內(nèi)外有關(guān)文獻(xiàn)，未發(fā)現(xiàn)該枯枝病的相關(guān)報道，為一種新病害。本文以在哈爾濱市東北林業(yè)大學(xué)校園中采到的樹錦雞兒枯枝病病枝及健康枝條為材料，依據(jù)柯赫氏法則，進(jìn)行了病原菌的分離和鑒定，確定了樹錦雞兒枯枝病的病原菌。為進(jìn)一步研究該真菌對樹錦雞兒的致病性、侵染途徑以及該病害的防治提供理論支持，打造科學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

2017年4月從東北林業(yè)大學(xué)校園采集到具有明顯病征的樹錦雞兒枯枝病病枝標(biāo)本數(shù)枝，帶回實驗室用做病原菌的形態(tài)學(xué)鑒定和分離的材料。并于病害標(biāo)本采集附近的樹錦雞兒和紫穗槐上采集健康的3～5 a生枝條做接種材料。

1.2 癥狀觀察

在校園中對樹錦雞兒枯枝病的發(fā)病癥狀進(jìn)行觀察。采集回來的病枝標(biāo)本借助手持放大鏡以及實體解剖鏡對發(fā)病部位進(jìn)行觀察，注意其危害部位和危害癥狀，以及其在寄主表面的排列狀況和顏色等。

1.3 病原菌的分離純化

將所采集具有典型癥狀的發(fā)病枝干標(biāo)本用自來水沖洗干凈，然后將發(fā)病部位產(chǎn)生的子實體連同樹皮沿枝干剝下，用滅菌紗布包起來放入到次氯酸鈣（1 ： 14倍）上清液中消毒4 min，取出用無菌水反復(fù)沖洗3次，再置于已滅菌的吸水紙上，吸干表面殘余水分后用滅菌的解刨刀從中間切開，切面朝下接入PDA培養(yǎng)基上，每皿放5塊組織材料，每組處理設(shè)6次重復(fù)，放入25 ℃的培養(yǎng)箱中進(jìn)行避光培養(yǎng)[13]。 分離純化后獲得純菌落，保存菌種于PDA斜面培養(yǎng)基上。

1.4 致病性測定

1.4.1 病菌接種

室內(nèi)接種采用劃傷、燒傷和無傷3種接種方法對健康的樹錦雞枝條進(jìn)行接種。采用離體枝條水培接種。分別用無菌水和樹錦雞兒樹皮煎汁（100 g樹皮，1 000 mL水，煮沸30 min 冷卻）將組織分離培養(yǎng)產(chǎn)生的病原菌孢子配成孢子懸浮液（數(shù)量大致為400倍鏡視野下200個孢子左右），以備接種。從園間采集3～5 a生的健康樹錦雞兒枝干，仔細(xì)清洗干凈，用枝剪剪成長20 cm左右小枝條，置于水龍頭下流水沖洗15 min進(jìn)行表面清潔，用保鮮膜將接種枝條的形態(tài)學(xué)上端封住，用酒精擦拭接種點。

無傷接種，隨機(jī)在健康且長勢較好的3～5 a生枝條上選取接種點。劃傷接種，用無菌手術(shù)刀劃5 mm×5 mm的“×”形傷口作為接種點，深度以劃破樹皮為準(zhǔn)。燒傷接種，將接種點置于酒精燈外焰上燒傷，時間約2 s，聽到樹皮有輕微爆裂聲即可，燒傷后樹皮僅出現(xiàn)直徑約5 ～ 7 mm的黃色爆皮區(qū)，燒傷如周圍樹皮顏色未見變化，且用刀片刮開樹皮可見內(nèi)部仍呈綠色，與未燒傷部位顏色相同如圖1（a）所示。用1 mL孢子懸浮液浸濕脫脂棉后包裹接種點。每組處理20株，接種后保鮮膜包扎保濕48 h。以上3種接種方法均以無菌水浸濕脫脂棉包裹為對照，并定期觀察病害的發(fā)生和發(fā)展情況。

同時對樹錦雞兒的同科植物紫穗槐進(jìn)行接種實驗。采用燒傷接種的方法進(jìn)行離體枝條水培接種，共接種20株，并以無菌水接種作為對照。檢測病原菌是否對豆科中的其他植物具有可侵染性。

根據(jù)室內(nèi)接種的結(jié)果選擇燒傷法進(jìn)行野外接種實驗。2017年6月采用麥芽汁液體培養(yǎng)基于25 ℃、160 rpm、黑暗條件下將病菌搖培7 d，用該菌液浸濕無菌脫脂棉進(jìn)行野外接種。共接種6株，每株選擇7個枝條，每個枝條設(shè)置一個接種點，接種后保鮮膜包扎保濕48 h。同時以無菌麥芽汁液體培養(yǎng)基浸濕脫脂棉包裹作為對照。

1.4.2 病原菌再分離

定期觀察接種枝條的發(fā)病狀況，對病原菌進(jìn)行再分離，純化。

1.5 病原菌形態(tài)特征鑒定

取發(fā)病枝條，對發(fā)病部位進(jìn)行切片鏡檢，觀察病原菌的形態(tài)，確認(rèn)是否有病原菌的繁殖體或營養(yǎng)體。將致病菌株接種在PDA培養(yǎng)基上，置于25 ℃，黑暗條件下培養(yǎng)。觀察其生長速度、菌落顏色和形態(tài)等，制成臨時玻片并在光學(xué)顯微鏡下觀察菌絲及其產(chǎn)孢狀況。

1.6 病原真菌ITS分子鑒定

選取分離自樹錦雞兒病枝上具有致病性的菌株，取3塊直徑為0.5 cm的菌塊接種于100 mLPD液體培養(yǎng)基中，25 ℃、160 rpm、黑暗條件下?lián)u培7 d，高速離心獲得孢子及菌絲體混合物。用快捷型植物基因組DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech （Beijing）?Co. ，LTD.）提取DNA。使用真菌通用引物ITS1（5-TCCGTAGGT -GAACCTGCGG-3）和ITS4（5-TCCGCTTATT-GATATGC-3）對樣品DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增[14]。

PCR產(chǎn)物委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行純化和測序。使用NCBI網(wǎng)站中的BLAST工具將測得的DNA序列進(jìn)行比對分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹錦雞兒枯枝病癥狀

樹錦雞兒枯枝病自然狀況下多發(fā)生在老齡或者衰弱枝條上，在一根枝條上一處或多處發(fā)生，子實體聚集或不規(guī)則散開，由于老齡枝條樹皮厚顏色深，僅能觀察到子實體的產(chǎn)生及枝條枯死，但在人工接種的條件下3～5 a生的枝條均可發(fā)病。接種枝條的發(fā)病初期產(chǎn)生淺黃色的病斑，后病斑逐漸擴(kuò)大且顏色加深。病原菌的子座初埋生于寄主皮下，肉眼可見樹皮下有小突起，后橫向開裂，突破樹皮，裂口處乳白色到淡黃色，光滑。子座逐漸外露，裂口處向外凸起，每個子座上產(chǎn)生1至多個分生孢子器，顏色逐漸加深變?yōu)槌赛S色，子座不規(guī)則形，表面不均勻。子實體的分布范圍隨病斑的擴(kuò)大而擴(kuò)大。成熟的分生孢子器在潮濕時會有大量孢子從孔口處涌出，在孔口處聚集，形成孢子粘液。

2.2 樹錦雞兒枯枝病病原菌分離的結(jié)果分析

通過對樹錦雞兒病枝進(jìn)行組織分離得到一種菌落顏色為白色的菌株，經(jīng)一段時間的培養(yǎng)后在菌落表面產(chǎn)生橙黃色的子實體，與樹錦雞兒枝條上產(chǎn)生子實體的形態(tài)特征十分相似。故將該菌株命名為S2，并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行該菌株的致病性測定。

2.3 致病性測定結(jié)果

2.3.1 室內(nèi)接種及發(fā)病組織再分離結(jié)果

從病枝分離的純培養(yǎng)物，在室內(nèi)采用無傷、劃傷和燒傷3種方法對健康的樹錦雞兒離體枝條進(jìn)行接種，每隔5 d觀察一次，記錄其發(fā)病情況。初始燒傷僅造成約直徑5 mm的爆皮區(qū)域;5 d后接種部位開始慢慢變色，變色區(qū)長約1.5 cm，寬約1 cm，隨時間的增加接種區(qū)變黃并開始向四周擴(kuò)展，交界部位顏色加深;在接種20 d時，燒傷接種的枝條上開始產(chǎn)生不同程度橢圓形的小突起，少數(shù)橫向開裂，裂口處乳白色，樹皮變?yōu)樯铧S色，且枝條的健康與發(fā)病部位的交界處顏色變黑;接種30 d，燒傷接種的枝條上產(chǎn)生與自然發(fā)病的病害標(biāo)本十分相似橙黃色的子實體，至此時發(fā)病面積已擴(kuò)散至長3 cm，寬1.5 cm（圖1）。其中燒傷接種的枝條發(fā)病較多，無傷接種條無發(fā)病現(xiàn)象，劃傷接種的接種部位顏色變深，初期略有塌陷，后期劃傷的邊緣部位開始突起，但始終未產(chǎn)生病原菌子實體。各接種方法的發(fā)病情況統(tǒng)計見表1。

對燒傷接種發(fā)病的枝條進(jìn)行組織分離，均能再次獲得了與S2相同的菌株。再分離后得到的菌株菌落形態(tài)、分生孢子器及分生孢子形態(tài)大小均與S2菌株一樣。即可確定S2菌株為引起樹錦雞兒枯枝病的病原菌。

對紫穗槐的接種枝條連續(xù)觀察30 d，接種病原菌的紫穗槐無任何癥狀。即該病原菌不能成功侵染紫穗槐。

2.3.2 野外接種結(jié)果

采用燒傷接種進(jìn)行野外接種。第12天枝條燒傷的部位開始出現(xiàn)不同程度的小突起和開裂，至第20天枝條接種部位產(chǎn)生橙黃色的子實體，接種42株，發(fā)病數(shù)為35株，發(fā)病率高達(dá)83.3%。對照組未見發(fā)?。▓D2）。

2.4 病原菌形態(tài)學(xué)及分子鑒定結(jié)果與分析

S2菌株在PDA培養(yǎng)基上25 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，表面白色，平板背面淡黃色。暗培養(yǎng)30 d后取出見光，見光7 ～ 10 d逐漸在菌落邊緣部分開始產(chǎn)生白色球狀的子座，成熟后變?yōu)槌赛S色。在病枝標(biāo)本上，該病原菌子實體為橙黃色至橙紅色，每個子座上產(chǎn)生1至多個分生孢子器。分生孢子梗為瓶梗狀，輪生2 ～ 8或單側(cè)再分枝。分生孢子單細(xì)胞，無色，圓柱形或輕微彎曲，（3.1～5.4）μm×（0.8～1.5）μm（= 50）。PD液體培養(yǎng)基在25 ℃搖培3 ～ 4 d后搖培液變渾濁，鏡檢發(fā)現(xiàn)菌絲上開始分枝產(chǎn)生分生孢子，產(chǎn)孢細(xì)胞瓶梗樣，7 d后鏡檢，400倍鏡下一個視野中孢子超過200個，但菌絲量很少，整個視野中幾乎全是孢子。根據(jù)以上形態(tài)特征鑒定該菌為樹錦雞子座叢赤殼菌（Stromatonectria caraganae）（圖3）。

將PCR擴(kuò)增得到的 r DNA-ITS 序列在NCBI BLAST上進(jìn)行比對，其中S2與GenBank中Stromatonectria caraganae（GenBank ID：HQ112288，菌株號：CBS 125579）的覆蓋度和相似度為99%。本文將樹錦雞兒枯枝病病原菌S2的序列在GenBank上進(jìn)行了注冊，菌株號為MG190345。結(jié)合形態(tài)學(xué)鑒定及相關(guān)文獻(xiàn)，鑒定此菌為樹錦雞子座叢赤殼菌。

3 結(jié)論與討論

根據(jù)柯赫氏法則對采集到的樹錦雞兒病枝進(jìn)行病原菌的分離、接種和再分離，確定病原菌。并根據(jù)菌落的形狀、顏色和生長速度，產(chǎn)生孢子及分生孢子器的基本形態(tài)進(jìn)行鑒定，得出該病原菌即為樹錦雞子座叢赤殼菌，與隨后的分子鑒定結(jié)論一致。

樹錦雞子座叢赤殼菌是子囊菌門（Ascomycota）、糞殼菌綱（Sordariomycetes）、肉座菌目（Hypocreales）、? 生赤殼科（Bionectriaceae） 、子座叢赤殼屬（ Stroma- tonectria）真菌。2011年M. Jaklitsch[15]等對該菌進(jìn)行了重新描述，在生赤殼科建立了一個新屬——子座叢赤殼屬（Stromatonectria），將該菌歸類于其中，并命名為樹錦雞子座叢赤殼菌（S. caraganae）。在國外該菌被發(fā)現(xiàn)寄生在豆科植物（Fabaceae）中錦雞兒（Caragana spp.）、魚鰾槐（Colutea arborescens）、金鏈花（Laburnum anagyroides）的樹枝上。在國內(nèi)僅發(fā)現(xiàn)于樹錦雞兒的樹枝上[16]，而對于其致病的方面，未見報道。

樹錦雞兒枯枝病病害調(diào)查的結(jié)果表明，自然條件下僅發(fā)現(xiàn)該病在樹錦雞兒的老齡及衰弱枝條上，但隨后進(jìn)行的致病性實驗則表明其在3～5 a生的健康枝條上亦可發(fā)生，無傷接種和劃傷接種不能發(fā)病，只有燒傷接種可大量發(fā)病，故該病原菌屬于一種弱寄生菌。且該菌的潛育期較短，燒傷接種30 d后就表現(xiàn)出典型癥狀。叢赤殼菌中可引起枯枝病的真菌種類還有很多，譬如2015年報道的油松枯枝病，該病害的發(fā)病癥狀與樹錦雞兒枯枝病相似，其病原菌為松叢赤殼菌（Nectria cucurbitula Sacc. ）。對該菌致病性測定的實驗結(jié)果表明，該菌不能通過寄主的自然孔口入侵[17]，與樹錦雞子座叢赤殼菌同屬于弱寄生性真菌。對松枯梢病的大量研究表明，該病害是一種寄主主導(dǎo)性病害，當(dāng)異常天氣的出現(xiàn)導(dǎo)致樹勢衰弱時，其致病能力增強[18-19]。

同時實驗數(shù)據(jù)表明，野外接種的發(fā)病率高達(dá)83.3%，比室內(nèi)接種發(fā)病率高出30%左右，且發(fā)病時間短，僅12 d就產(chǎn)生發(fā)病癥狀，比室內(nèi)接種提早8 d。這可能是因為野外接種的接種物為麥芽汁培養(yǎng)基搖培液，營養(yǎng)豐富，孢子濃度大且包含少量的菌絲;同時在時間方面也略有差異，室內(nèi)接種是在4月份進(jìn)行的，東北地區(qū)天氣寒冷，離體枝條本身營養(yǎng)有限且將其移入室內(nèi)溫暖環(huán)境后迅速長葉開花，導(dǎo)致枝條內(nèi)營養(yǎng)大量消耗，加上室內(nèi)環(huán)境較為干燥，不利于病原菌孢子的萌發(fā)與菌絲的生長;而野外接種是在6月份進(jìn)行的，接種時恰逢下雨，空氣潮濕而溫暖，加上枝條營養(yǎng)充分，為病原菌的定殖與擴(kuò)展創(chuàng)造了良好的條件，對接種實驗的結(jié)果也有一定的影響。該菌在病枝上成熟后產(chǎn)孢量大，分生孢子器在潮濕時會有大量孢子從孔口處流出，推測該菌在下雨時可以通過孢子隨雨水傳播。結(jié)合研究表明，若條件適合，該病也有大規(guī)模發(fā)生的可能性。在隨后進(jìn)行的實驗發(fā)現(xiàn)該病原菌在紫穗槐上不具有致病性，可見其寄主范圍不覆蓋所有的豆科植物，由于條件有限，對于豆科中其他木本植物是否具有普遍的致病性還需進(jìn)一步研究。

對于這種寄主主導(dǎo)的弱寄生性病害，可以采取適當(dāng)?shù)臓I林措施，預(yù)防為主，綜合治理[20]。通過撫育措施，適當(dāng)間伐與修枝，清除地表雜灌與野草，提高樹勢[21]。秋季植株進(jìn)入休眠期，要清除帶病及衰老枝條，并集中燒毀，減少病原菌來源。由于該病害寄主范圍較窄，可營造混交林，提高生物多樣性，防止病害的傳播和蔓延[22]。

同時在進(jìn)行病原菌鑒定的過程中，未發(fā)現(xiàn)該菌的有性型，在自然寄主及人工培養(yǎng)基上均以無性型的形式出現(xiàn)。國內(nèi)有關(guān)于該菌的研究較少，更多信息有待于進(jìn)一步研究。

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