兩性霉素B發(fā)酵染菌的原因分析及降低染菌率的措施

馬亦蓉

（上海上藥新亞藥業(yè)有限公司，上海201203）

0 引言

雖然兩性霉素B是由含37個(gè)碳原子組成的大環(huán)內(nèi)酯乳糖七烯類的抗生素，是治療全身性深度真菌感染的唯一有效藥物，但其副作用大、毒性大，而兩性霉素B脂質(zhì)體能有效彌補(bǔ)這一缺陷。

作為兩性霉素B脂質(zhì)體的原料來源——兩性霉素B，采用生物合成法（微生物發(fā)酵法）生產(chǎn)，利用兩性霉素B的產(chǎn)生菌，在一定的條件（包括培養(yǎng)基、溫度、pH、通氣、攪拌等）下使其生長繁殖，并在代謝過程中產(chǎn)生兩性霉素B，再用溶媒結(jié)晶法將兩性霉素B從發(fā)酵液中提取出來，加以精制，最后獲得兩性霉素B成品。

兩性霉素B的生產(chǎn)工藝（菌種→孢子制備→種子制備→發(fā)酵）屬于發(fā)酵生產(chǎn)工藝。然而，發(fā)酵生產(chǎn)工藝要求，除大量繁殖兩性霉素B的產(chǎn)生菌外，不允許其他雜菌（即染菌）的生長。染菌不僅消耗培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分，還會(huì)分泌某些對(duì)產(chǎn)生菌有毒性或者能使兩性霉素B失去活性的物質(zhì)。同時(shí)，降低兩性霉素B的發(fā)酵單位，嚴(yán)重時(shí)會(huì)導(dǎo)致“倒罐”，即發(fā)酵過程中出現(xiàn)了較為嚴(yán)重的染菌現(xiàn)象，意味著發(fā)酵失敗。因此，防止染菌，降低染菌率是發(fā)酵生產(chǎn)中一項(xiàng)長期、重要的工作。

本文從多方面入手，分析可能造成兩性霉素B發(fā)酵染菌的原因，并通過制定相應(yīng)的措施，降低染菌率。

1 發(fā)酵生產(chǎn)簡介

1.1 工藝流程

兩性霉素B的發(fā)酵工藝流程如圖1所示。

1.2 設(shè)備流程

兩性霉素B的發(fā)酵設(shè)備流程如圖2所示。

1.3 關(guān)鍵工藝簡述

將節(jié)狀鏈霉菌（Str.nodosus）培育至生產(chǎn)菌株，需經(jīng)種子階段、發(fā)酵階段的通氣培養(yǎng)，培養(yǎng)基由葡萄糖等原料作為碳源、酵母粉等原料作為氮源，并添加微量元素，整個(gè)培養(yǎng)繁殖過程應(yīng)保持嚴(yán)格的純種狀態(tài)。

在整個(gè)發(fā)酵過程中，需全程進(jìn)行雜菌試驗(yàn)，以此來判斷發(fā)酵過程是否染菌。通過觀察菌種外觀、鏡檢等手段來判斷從一級(jí)發(fā)酵進(jìn)入二級(jí)發(fā)酵（移種）的時(shí)機(jī)。兩性霉素B經(jīng)過發(fā)酵周期后，發(fā)酵液經(jīng)酸化過濾，收集濾餅（兩性霉素B菌絲體）。

圖1 兩性霉素B的發(fā)酵工藝流程

圖2 兩性霉素B的發(fā)酵設(shè)備流程

2 染菌事件的調(diào)查

在兩性霉素B發(fā)酵生產(chǎn)中發(fā)生了染菌事件，通過調(diào)查發(fā)現(xiàn)，其均為二級(jí)發(fā)酵間歇染菌，調(diào)查結(jié)果如表1所示，染菌情況嚴(yán)重，造成發(fā)酵效價(jià)低，過濾困難，只能作“倒罐”處理。

從表1可以看出：12批兩性霉素B發(fā)酵的染菌率為50%，染菌情況嚴(yán)峻。

3 染菌原因分析及要因確認(rèn)

兩性霉素B發(fā)酵生產(chǎn)中的染菌原因分析及要因確認(rèn)如表2所示。

在兩性霉素B發(fā)酵生產(chǎn)的染菌事故調(diào)查中，經(jīng)過染菌原因分析及要因確認(rèn)后，匯總并制成染菌原因魚刺分析圖，如圖3所示。

4 采取的控制措施

根據(jù)兩性霉素B的染菌原因魚刺分析圖，針對(duì)引發(fā)染菌的主要原因，制定相應(yīng)的控制措施，如表3所示。

4.1 空氣系統(tǒng)中水分過多

總空氣過濾器的失效多數(shù)是由空氣系統(tǒng)中水分過多造成，若不能有效除濕，過濾介質(zhì)極易失效，引起污染。針對(duì)這一情況，應(yīng)落實(shí)專人負(fù)責(zé)空氣系統(tǒng)的管理，定期檢查，定時(shí)消毒，及時(shí)放出冷凝水，并對(duì)空氣在進(jìn)入總過濾器之前加熱升溫，使得相對(duì)

表1 兩性霉素B發(fā)酵生產(chǎn)中染菌情況的調(diào)查

表2 兩性霉素B發(fā)酵生產(chǎn)中的染菌原因分析及要因確認(rèn)

4.2 罐體滲漏

圖3 兩性霉素B的染菌原因魚刺分析圖

表3 控制措施

對(duì)發(fā)酵罐進(jìn)行大范圍檢修，在罐體內(nèi)電焊捉漏，檢查夾套是否腐蝕穿孔，檢查管道和連接部件安裝是否合理；對(duì)罐壁、電焊縫滲漏處作相應(yīng)處理，嚴(yán)密堵漏。

4.3 罐內(nèi)設(shè)計(jì)不合理

（1）針對(duì)空氣分布口偏高，影響發(fā)酵液吸收溶氧的情況，應(yīng)降低空氣分布板位置，使分布口高度適宜，使發(fā)酵液有效吸收溶氧。

（2）針對(duì)罐內(nèi)出料管道口距罐底距離過大，影響發(fā)酵罐清洗，從而造成發(fā)酵罐染菌的情況，應(yīng)把原來高度在100mm左右出料的管道口改為基本接近罐底。

（3）針對(duì)排汽管道細(xì)，排汽不流暢，出現(xiàn)死角的情況，應(yīng)清理旋風(fēng)器，增加排汽出口，減少排汽死角。

4.4 蒸汽供應(yīng)壓力低或不穩(wěn)定

蒸汽供應(yīng)的壓力穩(wěn)定是保證發(fā)酵系統(tǒng)有效滅菌的基礎(chǔ)。若蒸汽壓力不穩(wěn)定，就會(huì)因?yàn)闇缇粡氐自斐晌廴?；若蒸汽壓力低，就?huì)造成滅菌時(shí)間長，進(jìn)而破壞培養(yǎng)基。

一般蒸汽由動(dòng)力車間供應(yīng)，因此，應(yīng)保證足夠壓力的飽和蒸汽及其穩(wěn)定性。

4.5 滅菌操作不到位

（1）為了提高相關(guān)操作人員的素質(zhì)，應(yīng)對(duì)操作人員進(jìn)行SOP教育培訓(xùn)，并進(jìn)行考核；

（2）強(qiáng)化管理，嚴(yán)格要求員工按照崗位SOP操作，認(rèn)真控制預(yù)熱溫度、罐溫及維持罐內(nèi)培養(yǎng)基溫度，嚴(yán)格控制進(jìn)料流量，保證滅菌質(zhì)量；

（3）抽查操作人員的工作情況，并與工資、獎(jiǎng)金掛鉤。

4.6 工藝弱點(diǎn)

針對(duì)消毒時(shí)液面高的現(xiàn)象，可提高某培養(yǎng)基使用比例，降低另一培養(yǎng)基使用比例，使消毒液面得以有效控制。

5 效果檢查與對(duì)比

在針對(duì)兩性霉素B的染菌主因，制定并落實(shí)了相應(yīng)的控制措施后，染菌情況大為改觀，染菌率直線下降，具體效果如表4所示。圖4為改進(jìn)前后兩性霉素B的平均效價(jià)對(duì)比，圖5為改進(jìn)前后兩性霉素B的染菌率對(duì)比。

圖5 改進(jìn)前后兩性霉素B的染菌率對(duì)比

從表4可以看出：12批兩性霉素B發(fā)酵的染菌率為8.33%，染菌問題大有改觀。

6 結(jié)語

本文從兩性霉素B的發(fā)酵工藝入手，介紹了兩性霉素B的發(fā)酵工藝流程和設(shè)備流程，通過分析可能造成發(fā)酵染菌的原因，結(jié)合實(shí)際情況，確定了發(fā)酵染菌的主要原因，并制定了相應(yīng)的控制措施，改進(jìn)后的染菌情況大為改觀。

表4 改進(jìn)后的染菌效果數(shù)據(jù)

圖4 改進(jìn)前后兩性霉素B的平均效價(jià)對(duì)比

同時(shí)，建議采取以下鞏固措施：

（1）制定管理標(biāo)準(zhǔn)，加強(qiáng)對(duì)設(shè)備等的定期檢查力度，每月進(jìn)行檢查、維修，發(fā)現(xiàn)問題及時(shí)解決；

（2）修正工藝規(guī)程，并寫入標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程；

（3）制定崗位培訓(xùn)計(jì)劃，對(duì)員工定期進(jìn)行各項(xiàng)規(guī)章制度、崗位操作規(guī)程及相關(guān)文件的培訓(xùn)，并嚴(yán)格遵照?qǐng)?zhí)行。

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