枇杷葉片發(fā)育基因EjGRF5與啟動子克隆及其在不同倍性枇杷中的表達(dá)

劉超，王玲利，吳頔，黨江波，尚維，郭啟高，梁國魯

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枇杷葉片發(fā)育基因與啟動子克隆及其在不同倍性枇杷中的表達(dá)

劉超1，王玲利2，吳頔1，黨江波1，尚維1，郭啟高1，梁國魯1

（1西南大學(xué)園藝園林學(xué)院，重慶 400715；2重慶市渝北區(qū)農(nóng)業(yè)委員會，重慶 401120）

【目的】克隆并解析枇杷（(Thunb.) Lindl.）中參與調(diào)控葉片生長發(fā)育的及其啟動子序列的結(jié)構(gòu)特征，研究其在不同倍性枇杷中的表達(dá)特性,為進(jìn)一步研究該基因調(diào)控不同倍性枇杷葉片生長勢差異的機(jī)理奠定基礎(chǔ)。【方法】從轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中挖掘枇杷的參考序列，以此序列設(shè)計(jì)引物，并以‘龍泉1號’四倍體枇杷基因組DNA為模板擴(kuò)增全長，參照參考序列獲得其CDS序列。利用Bioedit7.2及SignalP4.1對的CDS序列及其蛋白的理化性質(zhì)進(jìn)行分析；采用Mega7.0軟件構(gòu)建EjGRF5和其他物種GRF5的系統(tǒng)進(jìn)化樹；采用LocTree3及SoftBerry ProtComp9.0在線軟件對EjGRF5蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測；采用染色體步移的方法克隆的啟動子序列，并利用PlantCARE在線軟件對克隆得到的啟動子序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析；采用RT-PCR技術(shù)對在三倍體枇杷及其親本（4x、2x）中的表達(dá)差異進(jìn)行初步分析?！窘Y(jié)果】將測序結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序的參考序列進(jìn)行比對發(fā)現(xiàn)，全長為1 386 bp，含有3個外顯子，2個內(nèi)含子，內(nèi)含子全長399 bp，CDS全長987 bp。進(jìn)化樹分析表明，枇杷與薔薇科的其他植物高度同源，且與白梨的親緣關(guān)系最近。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，枇杷EjGRF5蛋白定位于細(xì)胞核中。啟動子分析顯示，啟動子區(qū)域含有多個順勢作用元件，包括脫落酸、乙烯、高溫、厭氧誘導(dǎo)、赤霉素和光響應(yīng)元件，并且光響應(yīng)元件多達(dá)11個。qRT-PCR結(jié)果顯示，除F1代A-6和B-3外，其余三倍體子代表達(dá)量相對于中間親本值（MPV）都發(fā)生了不同程度的上調(diào)，其中A-3的表達(dá)量是其MPV的20倍，A-5表達(dá)量是其MPV的18倍左右?！窘Y(jié)論】獲得了與枇杷葉片生長發(fā)育相關(guān)的、CDS序列及其啟動子序列，在三倍體枇杷葉片中的表達(dá)呈現(xiàn)出上調(diào)趨勢。

枇杷；；基因克??；啟動子克??；表達(dá)分析

0 引言

【研究意義】枇杷為薔薇科（Rosaceae）枇杷屬()植物，原產(chǎn)中國，別名盧橘。枇杷是亞熱帶地區(qū)的珍惜特產(chǎn)水果，其果實(shí)鮮美可口，柔軟多汁，營養(yǎng)豐富，有潤喉、止咳、健胃、清熱等功能，被譽(yù)為保健水果，深受國內(nèi)外消費(fèi)者的喜愛[1]。三倍體枇杷細(xì)胞核內(nèi)染色體組較二倍體增加一套，致使三倍體枇杷表現(xiàn)出許多二倍體枇杷所不具有的優(yōu)良性狀，如三倍體枇杷的葉片較二倍體變大，變厚，更加濃綠等[2]。而葉片是植物進(jìn)行光合作用的重要器官，直接影響到糖分的積累，是植物形態(tài)建成的一個重要方面，在植物生長發(fā)育過程中起重要作用[3]?；虮磉_(dá)與調(diào)控是植物接受外界信號進(jìn)行發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此，分離調(diào)控枇杷葉片發(fā)育的相關(guān)基因，有助于了解三倍體枇杷旺盛生長勢的分子機(jī)制，同時(shí)也為培育三倍體優(yōu)質(zhì)無核枇杷提供參考?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物葉片在發(fā)育過程中受多種基因調(diào)控，()是一類調(diào)控葉片發(fā)育的轉(zhuǎn)錄因子家族，研究人員在擬南芥中共鑒定出9個（—）家族成員[4]。對擬南芥以及水稻的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子通過結(jié)合到DNA鏈上以抑制或激活目標(biāo)基因的表達(dá)，不但在葉片的形成過程中起重要的調(diào)節(jié)作用，而且在植物的抗性、花器官發(fā)育等過程中也起到重要的調(diào)節(jié)作用[5]。然而遺傳學(xué)分析表明，在9個轉(zhuǎn)錄因子家族成員中，()對葉片形態(tài)發(fā)育的調(diào)控作用較其他8個轉(zhuǎn)錄因子更強(qiáng)，研究的也更加充分[6]。研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥突變體由于葉片細(xì)胞數(shù)目的變少而表現(xiàn)出葉片狹窄，而超表達(dá)則促進(jìn)了細(xì)胞分裂，進(jìn)而使得葉片變大[7]。Werner等[8]在對擬南芥細(xì)胞分裂素研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)的擬南芥植株隨著細(xì)胞分裂素的加速降解而表現(xiàn)出葉片大小的回復(fù)突變，因此認(rèn)為，在葉片的發(fā)育過程中，GRF5和細(xì)胞分裂素共同調(diào)控細(xì)胞的分裂進(jìn)而影響葉片的大小。最近在對擬南芥的研究中還指出，過表達(dá)不僅可以促進(jìn)細(xì)胞分裂，還可以加速葉綠體分裂，提高光合作用效率，延緩葉片衰老[9]?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前對研究主要集中在模式植物擬南芥上，而對木本植物轉(zhuǎn)錄因子的相關(guān)研究還鮮有報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究通過對枇杷轉(zhuǎn)錄因子基因及其啟動子進(jìn)行克隆并分析，采用qRT-PCR對在三倍體及其親本中（4x、2x）的表達(dá)量進(jìn)行分析，以明確及其啟動子的序列特征和在不同倍性枇杷中的表達(dá)模式，為進(jìn)一步研究該基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2016年11月至2017年7月在西南大學(xué)重慶市果樹學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行，田間采樣于2016年8月到2016年12月在重慶市北碚區(qū)歇馬鎮(zhèn)枇杷園進(jìn)行。

1.1 材料

供試材料主要包括兩個雜交組合所得到的三倍體植株及其相應(yīng)親本，雜交組合1：‘龍泉1號’四倍體(母本)，‘貴州1號’(父本)以及雜交所獲得的9株三倍體枇杷，編號為A-1、A-2.……A-9；雜交組合2：‘龍泉1號’四倍體(母本)，‘貴州23號’(父本)以及雜交所獲得的3株三倍體枇杷，編號為B-1、B-2、B-3。貴州1號及貴州23號均為二倍體野生枇杷，引自貴州，‘龍泉1號’四倍體為筆者實(shí)驗(yàn)室早年通過天然篩選得到的一株天然四倍體枇杷。取供試材料的幼嫩葉片放于液氮中，帶回實(shí)驗(yàn)室置于-80℃超低溫冰箱保存，用于后續(xù)克隆及定量分析。

工程菌DH5α及凝膠回收試劑盒購自北京天根公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、克隆載體pMD19-T，Universal GenomeWalkerTM2.0試劑盒購自Takara公司，Taq Plus DNA Polymerase 高保真聚合酶購自南京諾唯贊生物有限公司，EASYspin Plus plant RNA kit購自北京艾德萊生物科技有限公司。

1.2 基因克隆

采用改良的CTAB法提取‘龍泉1號’四倍體枇杷基因組DNA[10]。以轉(zhuǎn)錄組測序拼接得到的序列作為參考序列設(shè)計(jì)一對特異性引物：-F：5′-ATGATGAATGGAAATCCAAGTAG-3′；-R：5′-TTAACCGTCATTAGGACCTCCAG-3′，PCR反應(yīng)體系為25μL：2.5 μL 10×TaqPlus Buffer (Mg2+Plus)，0.5 μL dNTPs, 1 μL DNA，上、下游引物(10 μmol·L-1)各1 μL，TaqPlus DNA聚合酶0.25 μL、用ddH2O補(bǔ)至終體積25 μL。PCR反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min；94℃ 30 s，55℃30 s，72℃ 60 s，35個循環(huán)；72℃延伸7 min?；厥誔CR產(chǎn)物并連接到PMD19-T載體上，構(gòu)建重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽性克隆，送至成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司測序。測序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行Blast同源性比對，并結(jié)合轉(zhuǎn)錄組測序得到的參考序列進(jìn)行分析，得到枇杷的CDS序列，命名為。

1.3 啟動子克隆

以‘龍泉1號’四倍體基因組DNA為模板，依據(jù)Universal GenomeWalkerTM2.0啟動子克隆試劑盒說明書，以1.2中克隆得到的序列及后續(xù)測序得到的部分啟動子序列為依據(jù)，分批設(shè)計(jì)巢式引物，不斷往上游擴(kuò)增，直到擴(kuò)增出約 2 000 bp的啟動子序列。所用巢式引物如表1所示。

1.4 生物信息學(xué)分析

使用ORF finder 軟件分析基因的開放閱讀框（ORF）和編碼氨基酸序列；采用BioEdit7.2對CDS序列及其編碼的蛋白理化性質(zhì)進(jìn)行分析；采用SignalP 4.1預(yù)測EjGRF5蛋白的信號肽；Mega7.0 軟件構(gòu)建EjGRF5和其他物種GRF5的系統(tǒng)進(jìn)化樹；LocTree3（https://rostlab. org/services/loctree3/）和SoftBerry ProtComp9.0（http://linux1.softberry.com/berry. phtml）進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測[11-12]；采用在線軟件PlantCARE（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/ plantcare/html/）進(jìn)行啟動子序列分析。

1.5 枇杷EjGRF5的熒光定量表達(dá)分析

參照EASYspin Plus plant RNA kit試劑盒說明書提取枇杷總RNA，用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser合成cDNA。采用（筆者實(shí)驗(yàn)室前期篩選獲得）作為實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)的內(nèi)參基因。內(nèi)參基因的引物序列如表1所示。所用儀器為Stepone Real-Time PCR儀（ABI），所有qRT-PCR反應(yīng)都設(shè)3次重復(fù)。PCR反應(yīng)體系為10 μL：2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 5 μL，上、下游引物各0.2 μL，模板2 μL，50×ROX Refence Dye I0.2 μL，用RNAase Free H2O補(bǔ)至終體積10 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃預(yù)變性10 s，95℃ 5 s，60℃10 s；溶解曲線反應(yīng)程序：95℃15 s，60℃ 1 min，60—95℃（in 0.3 inc） 15 s。試驗(yàn)結(jié)果采用2-ΔΔCt法對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 EjGRF5克隆及序列分析

從枇杷基因組DNA中擴(kuò)增得到大小約1 500 bp的條帶，對該條帶回收、克隆、PCR鑒定和測序后，得到片段大小為1 386 bp，將測序得到的基因序列與轉(zhuǎn)錄組獲得的參考序列比對后發(fā)現(xiàn)，枇杷含有3個外顯子，2個內(nèi)含子。內(nèi)含子全長399 bp，外顯子即CDS序列。全長987 bp，其所編碼的氨基酸序列與和核苷酸序列相對應(yīng)，如圖1所示。序列及CDS序列已提交至NCBI注冊，序列號分別為：MF772342、MF772341。CDS的A+T含量為53.29%，G+C含量為46.71%，編碼328個氨基酸，蛋白相對分子質(zhì)量為36.5 kD，等電點(diǎn)為8.91。其氨基酸殘基中含有30個帶負(fù)電的氨基酸殘基，36個帶正點(diǎn)的氨基酸殘基，76個疏水氨基酸，128個極性氨基酸。通過SignalP 4.1在線軟件進(jìn)行信號肽預(yù)測發(fā)現(xiàn)，EjGRF5蛋白無信號肽序列，為一種非分泌蛋白。

表1 引物用途及序列

圖1 EjGRF5核苷酸序列及其氨基酸序列

2.2 EjGRF5進(jìn)化分析

利用Mega7.0上的鄰接法（neighbour-joining，NJ）對枇杷EjGRF5蛋白、GenBank數(shù)據(jù)庫中有記載的20個GRF5蛋白進(jìn)行進(jìn)化樹構(gòu)建（圖2），結(jié)果表明，枇杷EjGRF5與薔薇科中的一些植物，如白梨、蘋果、甜櫻桃、梅花、碧桃等的親緣關(guān)系較近，其中與白梨的親緣關(guān)系最近，由此明確EjGRF5為薔薇科家族成員。

圖2 EjGRF5與其他植物GRF5蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析（鄰接法）

2.3 EjGRF5亞細(xì)胞定位預(yù)測

通過在線預(yù)測軟件SoftBerry ProtComp9.0對EjGRF5蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位預(yù)測，結(jié)果顯示，EjGRF5蛋白定位在細(xì)胞核的相應(yīng)預(yù)測數(shù)值最高，為9.04。采用在線預(yù)測軟件LocTree3對EjGRF5蛋白亞細(xì)胞定位進(jìn)行進(jìn)一步預(yù)測，結(jié)果顯示，EjGRF5蛋白同樣定位于細(xì)胞核。由此判斷，EjGRF5蛋白可能為一核蛋白。

2.4 EjGRF5啟動子克隆與分析

根據(jù)序列設(shè)計(jì)巢式引物，依據(jù)Universal GenomeWalkerTM2.0試劑盒說明書進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增，經(jīng)過5輪巢式PCR、測序以及拼接后得到了一條大小約2 200 bp的序列。采用PlantCARE在線軟件對其序列(1 500 bp)進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn)，啟動子序列含有3個植物激素相應(yīng)元件（ABRE、CE3、GARE-motif）、11個光響應(yīng)元件（AE-box、ATCT-motif、Box4、BoxI、CAG-motif、G-Box、G-box、GA-motif、GT1-motif、MNF1、Sp1）、1個乙烯相應(yīng)元件（ERE）、1個高溫相應(yīng)元件（HSE）等（表2），說明的轉(zhuǎn)錄表達(dá)可能受到這些因子的調(diào)控，并且對光照的變化十分敏感。

2.5 EjGRF5在親本（2x，4x）及其三倍體子代中的表達(dá)模式

利用qRT-PCR技術(shù)，對在親本（4x、2x）及其三倍體中的表達(dá)進(jìn)行分析。中間親本值（Middle- Parent-Value，MPV）是衡量雜種優(yōu)勢的一個重要指標(biāo)，根據(jù)親本基因組在三倍體子代中的貢獻(xiàn)率，計(jì)算出中間親本值（MPV），即：MPV=2/3ב龍泉1號’（4x）+1/3ב貴州1號’（2x）（‘貴州23號’（2x））。在分析三倍體表達(dá)量變化時(shí)，采用MPV值作為對照，將子代及其親本的表達(dá)量與MPV進(jìn)行比較，計(jì)算出2-△△Ct。分析結(jié)果顯示，‘貴州1號’（2x）和‘貴州23號’2x的表達(dá)量要顯著低于‘龍泉1號’（4x），如圖3中箭頭所示。在兩個雜交組合中，僅有三倍體A-6和B-3表達(dá)相對于MPV發(fā)生了下調(diào)，其他三倍體的表達(dá)量都較MPV發(fā)生了不同程度的上調(diào)，其中A-3的表達(dá)量是MPV的20倍，A-5表達(dá)量是MPV的18倍左右，中親優(yōu)勢明顯。且A-2、A-3及A-5的表達(dá)量還明顯高于‘龍泉1號’（4x），超親優(yōu)勢明顯，如圖3所示。這說明在三倍體枇杷葉片中的上調(diào)表達(dá)可能是導(dǎo)致三倍體枇杷葉片變大的一個重要因素。

表2 EjGRF5基因上游啟動子順式調(diào)控元件預(yù)測

圖3 EjGRF5在三倍體子代及其親本（4x, 2x）中的實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析

3 討論

近年報(bào)道的GRFs轉(zhuǎn)錄因子家族共有9個成員，其在葉片的生長發(fā)育過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用，GRF5轉(zhuǎn)錄因子是GRFs轉(zhuǎn)錄因子家族中研究的較多且較充分的一個轉(zhuǎn)錄因子。研究指出，轉(zhuǎn)錄因子參與了葉片各個組織從葉原基分化后直至完全成熟這個階段的發(fā)育調(diào)控[13-14]。遺傳學(xué)分析表明，轉(zhuǎn)錄因子需與轉(zhuǎn)錄共激活子()相互作用，通過聚集SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物來調(diào)節(jié)葉片的大小及性狀[15-17]。在擬南芥中，研究人員發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)葉片生長時(shí)，還能夠與另外8個GRFs轉(zhuǎn)錄因子家族成員中的一個或多個共同調(diào)節(jié)葉片的生長[18-19]。為此，通過克隆枇杷葉片為進(jìn)一步探究三倍體枇杷葉片生長發(fā)育特點(diǎn)提供理論依據(jù)。本研究克隆得到枇杷，同源比對發(fā)現(xiàn)其EjGRF5蛋白與薔薇科中已報(bào)道的GRF5序列有較高的同源性，說明他們在進(jìn)化上是高度保守的。

啟動子在調(diào)控基因表達(dá)中起重要的作用[20]，本研究采用染色體步移的方法成功克隆到枇杷起始密碼子上游2 200 bp的啟動子片段。通過對啟動子序列的生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，其含有3個植物激素相應(yīng)原件，1個高溫相應(yīng)元件，1個乙烯相應(yīng)元件，然而，與光響應(yīng)的元件達(dá)到11個，暗示光照對的表達(dá)可能具有重要的誘導(dǎo)作用[21-22]。這也為進(jìn)一步研究在三倍體枇杷中的表達(dá)機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

筆者課題組早期觀察發(fā)現(xiàn)，三倍體枇杷的葉片較其親本（4x，2x）表現(xiàn)出不同程度的變大、變厚、變綠[2,23]，因此推測，三倍體枇杷的表達(dá)發(fā)生了上調(diào)。利用qRT-PCR對在親本（2x，4x）及其三倍體中進(jìn)行表達(dá)分析，結(jié)果顯示，在兩個雜交組合中，僅有子代A-6和B-3相對于中間親本值（MPV）的表達(dá)發(fā)生了下調(diào)，其他三倍體的表達(dá)量都較MPV發(fā)生了不同程度的上調(diào)。然而，在所研究的三倍體中，僅有A-2、A-3及A-5的表達(dá)量明顯高于‘龍泉1號’（4x），表現(xiàn)出明顯的超親優(yōu)勢，而除B-3外，幾乎所有的三倍體表達(dá)量都高于二倍體父本。而前人的研究表明，基因的劑量效應(yīng)可能對基因的表達(dá)量產(chǎn)生影響[24-25]。因此，不同倍性枇杷表達(dá)量的差異是否受到了基因劑量的影響還有待進(jìn)一步的研究。除此之外，基因表達(dá)還受其他多種因素的調(diào)控，如SiRNA[26-29]、DNA甲基化[30-31]等。然而，關(guān)于在三倍體及其親本中的表達(dá)差異機(jī)理目前還知之甚少，有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究分離了控制枇杷葉片生長發(fā)育的相關(guān)基因全長及其CDS序列，發(fā)現(xiàn)EjGRF5蛋白與薔薇科植物中的GRF5蛋白高度同源。對的啟動子區(qū)域分析發(fā)現(xiàn)，其啟動子序列含有多個受光誘導(dǎo)的順勢調(diào)控元件。QRT-PCR發(fā)現(xiàn)，除A-6和B-3外，在三倍體枇杷中的表達(dá)量都較MPV值有不同程度的上調(diào)，研究結(jié)果為進(jìn)一步探索三倍體枇杷葉片生長旺盛的相關(guān)機(jī)理奠定了基礎(chǔ)。

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Molecular Cloning of Leaf Developmental Gene, Its Promoter and Expression Analysis in Different Ploidy Loquat ((Thunb.) Lindl.)

LIU Chao1, WANG Lingli2, WU Di1, DANG Jiangbo1, SHANG Wei1, GUO Qigao1, LIANG Guolu1

(1College of Horticulture and Landscape Architecture, southwest university, Chongqing 400715;2Technical Advice Station of Economic Crop, Chongqing 401120)

【Objective】 In order to provide more details for further studying the mechanisms ofgene in regulating the growth vigor of different ploidy loquat leaf, the aims of this study are to isolate the code region ofgene which is involved in the regulation of leaf development and its promoter sequence, and illustrate the expression pattern of the【Method】 The primers were designed by using thereference s equence obtained from the RNA-Seq, and the full length ofwas cloned by using the genome DNA of Longquan-1 tetraploid, and then the full length and reference sequences were compared to obtain the targeted sequence. The Bioedit7.2 and SignalP4.1 were used to analyze the structure of theCDS and the physical and chemical properties of EjGRF5; Mega7.0 was used to construct the EjGRF5 phylogenetic tree. The online software of LocTree3 and SoftBerry ProtComp9.0 was adopted to predict the subcellular location of EjGRF5. The genome walking technique was employed to amplify the promoter sequence, and the online software PlantCARE was adopted to analyze the structure of the promoter. The expression patterns of【Result】 When Comparing the sequenced data with the reference sequence of, the results showed that the full length ofis 1368 bp and it contains three extron and two intron sequences. The CDS length ofis 987 bp. The results of phylogenetic analysis revealed that the EjGRF5 protein is highly homologous with some other species in Rosaceae and is closest to. The result of subcellular localization prediction showed that EjGRF5 protein is located in the nucleus. The promoter analysis indicated that there were multiple putative-acting elements involved in the responsive elements, including abscisic acid (ABA), ethylene, heat, anaerobic inductive, gibberellin (GA) and light. Moreover, the number of light responsiveness element has reached 11. QRT-PCR result showed that the expression level ofexhibit varying degrees of up-regulation in almost all of the triploids except the hybrids A-6 and B-3 compared with the middle-parent value (MPV). Among the hybrids, the expression of A-3 was 20 times higher than that of MPV and A-5 was about 18 times higher than that of MPV. 【Conclusion】 The coding region and CDS sequence ofgene which is related to the development of loquat leaves were isolated, and the qRT-PCR results indicated that the expression ofion.

loquat;; gene cloning; promoter cloning; expression analysis

（責(zé)任編輯 趙伶俐）

10.3864/j.issn.0578-1752.2018.08.017

2017-09-01；

2018-01-10

‘十二五’國家科技支撐計(jì)劃（2013BAD02B02-1）、國家星火計(jì)劃（2015GA811003）、國家林業(yè)局項(xiàng)目（渝林科推2016-03）、重慶市林業(yè)局項(xiàng)目（渝林科研2016-10）、國家青年科學(xué)基金（31701876）、重慶市科委基礎(chǔ)科學(xué)與前沿技術(shù)研究項(xiàng)目（cstc2017jcyjA1154）

劉超，E-mail：liuchao8807@126.com。

郭啟高，E-mail：qgguo@126.com。通信作者梁國魯，E-mail：lianggl@swu.edu.cn