水稻黃綠葉基因Yellow-Green Leaf 6 (YGL6)的表達(dá)模式與蛋白定位

施軍瓊 王亞琴 張?zhí)烊?馬 玲 桑賢春 何光華,*

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水稻黃綠葉基因Yellow-Green Leaf 6 (YGL6)的表達(dá)模式與蛋白定位

施軍瓊1,2王亞琴1張?zhí)烊?馬 玲1桑賢春1何光華1,*

1西南大學(xué)水稻研究所 / 轉(zhuǎn)基因植物與安全控制重慶市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400716;2西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院, 重慶 400716

葉色突變既可作為形態(tài)標(biāo)記用于雜交稻育種, 又是研究光合系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)和功能、葉綠素生物合成及其調(diào)控機(jī)制的理想材料。EMS (ethyl methane sulfonate)誘變秈稻恢復(fù)系“縉恢10號(hào)”獲得1個(gè)穩(wěn)定遺傳的黃綠葉突變體, 暫命名為(。前期我們通過(guò)圖位克隆篩選出候選基因, 通過(guò)遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)了黃綠葉基因?yàn)? BLASTp分析表明基因編碼NAD(P)-結(jié)合的Rossmann折疊超家族蛋白質(zhì), 屬于短鏈脫氫酶/還原酶家族, 推斷為異黃酮還原酶、糖脫水酶或mRNA結(jié)合蛋白。利用qRT-PCR進(jìn)行表達(dá)模式的分析表明基因僅在綠色組織如心葉、成熟葉、葉鞘和綠色穎殼中表達(dá), 尤其以心葉的表達(dá)量最高, 同時(shí)基因表達(dá)還受光照的誘導(dǎo)。構(gòu)建亞細(xì)胞定位載體, 轉(zhuǎn)水稻原生質(zhì)體結(jié)果表明YGL6蛋白定位于葉綠體。本研究豐富了水稻突變體庫(kù), 為基因的功能分析奠定了基礎(chǔ)。

水稻(); 黃綠葉;基因; 葉綠體; 表達(dá)模式

水稻葉色突變是比較常見(jiàn)的, 突變基因往往直接或間接影響葉綠素的合成和降解, 從而影響水稻光合作用, 造成植株減產(chǎn)甚至死亡。近年來(lái), 大量研究結(jié)果顯示, 葉色突變體是植物光合作用機(jī)制、葉綠素生物合成途徑、葉綠體的結(jié)構(gòu)功能和遺傳發(fā)育調(diào)控機(jī)理、作物標(biāo)記性狀等研究的理想材料[1-3]。

水稻葉綠素缺乏突變類型豐富, 目前已鑒定突變體90多個(gè), 除第12染色體外, 其他染色體均發(fā)現(xiàn)了葉綠素缺乏突變基因(http://www.shigen.nig.ac. jp/rice/oryzabaseV4/)。雖然其大部分已被定位, 但僅少數(shù)被克隆, 它們分別參與葉綠素的生物合成、降解和葉綠體的發(fā)育[4,5-12]。葉色突變的機(jī)制復(fù)雜, 除葉綠素代謝和葉綠體發(fā)育引起外, 還有質(zhì)-核信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑受阻[13]、血紅素的反饋調(diào)節(jié)紊亂[14]、光敏色素調(diào)控受阻[15]、葉綠體蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)受阻[16]、ATP轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因[17]等其他突變機(jī)制。隨著新的水稻葉色突變體的發(fā)現(xiàn), 葉色突變相關(guān)基因的分子機(jī)理研究將更加透徹。

葉綠體RNA結(jié)合蛋白是一類定位于葉綠體, 參與葉綠體RNA代謝的由核基因編碼的蛋白。葉綠體RNA結(jié)合蛋白與細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)中的RNA結(jié)合蛋白具有類似的功能, 包括參與RNA的穩(wěn)定和RNA轉(zhuǎn)錄后的加工過(guò)程等。此外, 葉綠體RNA結(jié)合蛋白對(duì)細(xì)胞核與葉綠體之間的信息傳遞和功能協(xié)調(diào)起重要作用。本研究利用EMS誘變恢復(fù)系縉恢10號(hào), 從其后代中獲得一份穩(wěn)定遺傳的黃綠葉突變體, 該突變體葉片在苗期呈黃綠色, 分蘗后期至成熟期轉(zhuǎn)為淡綠色。圖位克隆及測(cè)序結(jié)果表明為候選基因, 遺傳互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)證實(shí)黃綠葉基因?yàn)椤８鶕?jù)gramene網(wǎng)站(http://www. gramene.org/)提供的信息, YGL6蛋白屬于RNA結(jié)合蛋白類, 利用qRT-PCR分析表明基因僅在綠色組織如心葉、成熟葉、葉鞘和綠色穎殼中表達(dá), 并受光照條件的誘導(dǎo)。構(gòu)建與的融合表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體發(fā)現(xiàn)YGL6與GFP的融合蛋白定位于葉綠體, 因此YGL6極有可能是葉綠體中的RNA結(jié)合蛋白, 并參與了水稻葉綠體的發(fā)育過(guò)程。本研究初步揭示了的基因功能, 為進(jìn)一步研究奠定了基礎(chǔ), 并豐富了水稻突變體庫(kù), 深化了當(dāng)前對(duì)葉綠體發(fā)育過(guò)程的研究。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

黃綠葉突變體由EMS誘變縉恢10號(hào) (Jinhui 10)所得, 經(jīng)多代培養(yǎng)已遺傳穩(wěn)定?？N恢10號(hào)是西南大學(xué)水稻研究所選育的優(yōu)良秈稻恢復(fù)系, 以其作為野生型對(duì)照。

1.2 基因組互補(bǔ)載體的設(shè)計(jì)、構(gòu)建與轉(zhuǎn)化

由于pCAMBIA1301上的單酶切位點(diǎn)在基因的基因組DNA序列均存在, 并且擴(kuò)增片段較長(zhǎng), 則采用重組酶的方法進(jìn)行。引物6HBF1和6HBR2分別與載體pCAMBIA1301H I和d III酶切后的片段有15 bp的重疊; 引物6HBR1和6HBF2有15 bp的重疊用于連接前后2個(gè)擴(kuò)增片段的重疊片段。引物6HBF1、6HBR2、6HBF2、6HBR1的序列分別為5￠-cggtacccggggatcAACATGGTCAGGCACA GTGATGAGAT-3￠、5￠-AGATAGGAGATGGTAGCAG GAGGCTG-3￠、5￠-TACCATCTCCTATCTCTGACTTC AGTAGTGC-3￠和5￠-GGCCAGTGCCAAGCTGGTC AAGCTCCCTGGTGAGGCTAT-3￠。載體參照Shi等[18]的方法構(gòu)建與轉(zhuǎn)化。

1.3 YGL6蛋白的進(jìn)化分析

參照Ren等[19]的方法分析YGL6蛋白的進(jìn)化。

1.4 基因表達(dá)分析

參照Shi等[18]的方法進(jìn)行RNA的提取和純化、cDNA的合成和qRT-PCR的表達(dá)分析。

1.5 光合色素含量的測(cè)定

以野生型、突變體和互補(bǔ)植株為材料, 上午9:00在種植小區(qū)中間隨機(jī)選擇長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)一致的5個(gè)單株, 測(cè)定葉片中部的光合色素含量。稱取0.1 g葉片剪碎裝入離心管, 加25 mL丙酮∶無(wú)水乙醇(1∶1, v/v) 混合液封口暗處理24~48 h, 其間經(jīng)常搖動(dòng), 每個(gè)樣品重復(fù)3次。用分光光度計(jì)測(cè)定470 nm、645 nm和663 nm的光吸收值, 參考Lichtenthaler[20]的方法計(jì)算。

1.6 亞細(xì)胞定位

選擇載體pTCK303為載體骨架, 其上的Ubiquitin為啟動(dòng)子,H I和I為雙酶切位點(diǎn)。設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增基因的整個(gè)CDS片段, 前引物ATG前加入來(lái)自pTCK303H I酶切后Ubiquitin側(cè)15 bp, 后引物不含終止密碼子。再設(shè)計(jì)1對(duì)引物擴(kuò)增基因的整個(gè)CDS片段, 前引物與的后引物有15 bp的重疊, 后引物加入來(lái)自pTCK303I酶切后NOS側(cè)15 bp堿基。引物6OEPF1、6OEPR1、6GFPF1和6GFPR1的序列分別為5￠-tacttc tgcaggatcATGGCAGCAACAGCCTCCCT-3￠、5￠-tcacc atgacgctgaCGAGCTTCTTGCC-3￠、5￠-tcagcgtcatggtga GCAAGGGCGAGGA-3￠和5￠-CAAATGTTTGAAC GGTTACTTGTACAGCTCGTCCATGCCG-3￠。參照Ren等[19]轉(zhuǎn)水稻原生質(zhì)體的亞細(xì)胞定位方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 YGL6基因組互補(bǔ)驗(yàn)證

為了驗(yàn)證通過(guò)圖位克隆篩選出的候選基因就是基因[18], 構(gòu)建了基因組互補(bǔ)載體, 將野生型中基因組片段包括上游3500 bp、編碼框和下游1500 bp序列利用重組酶整合到pCAMBIA1301表達(dá)載體中, 然后通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法遺傳轉(zhuǎn)化突變體。在T0獲得的轉(zhuǎn)基因植株中, 共觀察到12株轉(zhuǎn)基因植株的突變體表型得以恢復(fù)(圖1-A, B)。同時(shí)通過(guò)提取DNA后測(cè)序比對(duì)發(fā)現(xiàn), 12株轉(zhuǎn)基因植株在突變位點(diǎn)均出現(xiàn)了雙峰, 證實(shí)互補(bǔ)載體成功轉(zhuǎn)入突變體, 使其表型得以恢復(fù)正常(圖1-C)。分析表明恢復(fù)表型的轉(zhuǎn)基因植株的葉綠素、葉綠素和類胡蘿卜素含量均達(dá)到了野生型的色素含量水平(圖1-D)。

圖1 YGL6基因的互補(bǔ)驗(yàn)證

A: WT、和轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)植株; B: WT、和轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)植株的葉片; C: WT、和轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)植株突變位點(diǎn)的測(cè)序結(jié)果; D: WT、和轉(zhuǎn)基因互補(bǔ)植株的色素含量。*表示在0.05水平上差異顯著。

A: phenotypes of WT,mutant,and transgenic plant (/); B: leaves of WT,mutant, and transgenic plant; C: thesequencing of WT,mutant, and transgenic plant; D: pigment contents of WT,mutant, and transgenic plant. *﹤0.05.

2.2 YGL6蛋白質(zhì)功能注釋與進(jìn)化分析

通過(guò)比對(duì)水稻基因組序列, 在其他位置未發(fā)現(xiàn)與基因高度相似的序列, 表明基因是單拷貝基因。利用NCBI網(wǎng)站對(duì)YGL6蛋白質(zhì)BLASTp分析表明,基因編碼NAD(P)-結(jié)合的Rossmann折疊超家族蛋白質(zhì), 屬于短鏈脫氫酶/還原酶家族, 推斷為異黃酮還原酶、糖脫水酶和mRNA結(jié)合蛋白等。YGL6蛋白質(zhì)具有多個(gè)保守結(jié)構(gòu)域, 如SDR-a1結(jié)構(gòu)域、NAD(P)-結(jié)合位點(diǎn)、UDP-葡萄糖-4-異構(gòu)酶C末端亞基、短鏈脫氫酶、RNA結(jié)合蛋白、NAD依賴的異構(gòu)酶家族等。

YGL6蛋白在網(wǎng)站gramene (http://www.gramene. org/)預(yù)測(cè)是一個(gè)RNA結(jié)合蛋白, 生物信息學(xué)分析該蛋白質(zhì)定位于葉綠體, 系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)分析表明其與其他物種的葉綠體莖環(huán)結(jié)合蛋白聚類在一起。從系統(tǒng)進(jìn)化中可以看出, 該基因?qū)儆诟弑Ｊ氐涂截? 從藻類、苔蘚到高等植物均含有此蛋白, 并且藻類、苔蘚、單子葉和雙子葉植物各自組成一個(gè)分支(圖2)。

2.3 YGL6基因的表達(dá)分析

通過(guò)qRT-PCR檢測(cè),基因在苗期除根外, 心葉、成熟葉和葉鞘中均有表達(dá), 尤以心葉的表達(dá)量最高, 達(dá)到成熟葉的6倍多(圖3-A); 在孕穗期, 僅在葉片和葉鞘中有表達(dá), 在心葉的表達(dá)量最高; 在抽穗期的綠色穎殼中也有表達(dá)(圖3-B)。以上結(jié)果表明基因在整個(gè)生育期的綠色部位表達(dá), 尤以心葉的表達(dá)量最高。

2.4 YGL6基因表達(dá)受光照的影響

對(duì)連續(xù)暗培養(yǎng)14 d的水稻幼苗光照處理表明, 隨著光照時(shí)間的延長(zhǎng),基因的表達(dá)量不斷上升(圖4-A)。對(duì)連續(xù)光培養(yǎng)14 d的水稻幼苗進(jìn)行黑暗處理表明暗培養(yǎng)0.5 h表達(dá)量下降, 但隨后表達(dá)量逐漸上升, 在4 h時(shí)達(dá)到最大表達(dá)量, 隨后逐漸下降, 在24 h時(shí)降到最低表達(dá)量(圖4-B)。以上結(jié)果表明基因的表達(dá)受光照的誘導(dǎo)。

圖2 YGL6基因的進(jìn)化分析

圖3 YGL6基因表達(dá)分析

A: 苗期基因在WT和的表達(dá)分析; B: 孕穗期基因在WT的表達(dá)分析。*表示在0.05水平上差異顯著。

A: expression level ofat seedling stage in WT and themutant; B: expression level ofat booting stage in WT. *﹤0.05.

2.5 YGL6蛋白的亞細(xì)胞定位

亞細(xì)胞定位分析網(wǎng)站(http://www.cbs.dtu.dk/ services/SignalP/)預(yù)測(cè)YGL6蛋白定位于葉綠體, 為了驗(yàn)證YGL6蛋白是否定位于葉綠體, 構(gòu)建了35S-ORF-GFP和35S-GFP融合瞬時(shí)表達(dá)載體。將瞬時(shí)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化水稻原生質(zhì)體, 用綠色熒光蛋白GFP做指示。結(jié)果表明, 在轉(zhuǎn)35S-GFP原生質(zhì)體, 除液泡外綠色熒光信號(hào)在整個(gè)細(xì)胞中均能觀察到(圖5-A~D); 而在轉(zhuǎn)35S-ORF-GFP的原生質(zhì)體中, GFP的綠色熒光信號(hào)(圖5-E)和葉綠體自發(fā)的紅色熒光信號(hào)(圖5-F)重疊為黃色(圖5-H), 說(shuō)明YGL6蛋白定位在葉綠體。

3 討論

在眾多被鑒定的葉色突變體中, 僅有少數(shù)基因被克隆。葉綠素生物合成和葉綠體發(fā)育是一個(gè)相當(dāng)復(fù)雜的過(guò)程, 目前已克隆的水稻葉色突變基因直接或間接影響葉綠素代謝或者葉綠體的發(fā)育。直接參與編碼葉綠素合成與降解的酶基因有編碼鎂離子螯合酶H、D和I亞基的[7]、和[11]基因, 葉綠素酸酯氧化酶基因、[8], 葉綠素合成酶基因[12]。調(diào)控葉綠體發(fā)育的基因有鳥(niǎo)苷酸激酶基因[9-10], 三角狀五肽重復(fù)蛋白基因[21], 葉綠體RNA聚合酶基因[22]等。此外已成功克隆出的葉色相關(guān)基因還有持綠突變體基因()[23], 葉綠素還原酶基因()[24], 葉綠素還原酶的同源基因[25]等。通過(guò)圖位克隆和基因互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)表明基因是一個(gè)位于第12染色體的SDR超家族基因, 雖然目前已發(fā)現(xiàn)的葉色突變相關(guān)基因有90多個(gè), 但在第12染色體鮮有葉色突變的報(bào)道, Shi等首次報(bào)道了突變體[18], 本研究證實(shí)了是一個(gè)調(diào)控葉色突變的基因。

圖4 光照對(duì)YGL6基因表達(dá)的分析

A: 連續(xù)黑暗培養(yǎng)后在不同光照時(shí)間基因的表達(dá); B: 連續(xù)光照培養(yǎng)后在不同黑暗時(shí)間基因的表達(dá)。

A: expression level ofin wild-type plants at different hours transferred to continuous light from continuous darkness; B: expression level ofin wild-type plants at different hours transferred to continuous darkness from continuous light.

圖5 YGL6蛋白的亞細(xì)胞定位

A~D: 陰性對(duì)照(35S-GFP); E~H: YGL6蛋白定位(35S-ORF-GFP)。

A-D: negative control (35S-GFP); E-H: subcellular location of YGL6 protein (35S-ORF-GFP).

最近有研究表明, 葉綠體有不同的RNA池, 其中有些RNA被翻譯, 而其他的并不被翻譯[26]。細(xì)菌RNA轉(zhuǎn)錄后即被翻譯, 剪切、RNA編輯、內(nèi)含子剪接等轉(zhuǎn)錄后加工在細(xì)菌中較少存在[27]。然而, 葉綠體的初級(jí)RNA產(chǎn)物均需要不同形式的轉(zhuǎn)錄后加工[28]。細(xì)菌的多順?lè)醋又苯舆M(jìn)行翻譯, 而葉綠體的多順?lè)醋有枰M(jìn)一步剪切產(chǎn)生更小的多順?lè)醋踊騿雾樂(lè)醋覴NA, 有些還需要進(jìn)一步的剪切或編輯產(chǎn)生成熟的RNA[28-29]。多數(shù)質(zhì)體RNA的成熟需要低特異性的核酸酶, 加工的程度通常由RNA結(jié)合蛋白和RNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)決定[28-29]。葉綠體RNA代謝需要數(shù)量眾多的RNA結(jié)合蛋白的參與, YGL6具有mRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域, 亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示YGL6蛋白定位于葉綠體。綜合上述結(jié)果可以確定基因是一個(gè)新的調(diào)控水稻葉綠體RNA代謝的基因, 有助于更進(jìn)一步理解和完善水稻葉色突變的機(jī)制。

利用NCBI網(wǎng)站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)對(duì)YGL6蛋白質(zhì)BLAST分析表明,基因編碼NAD(P)-結(jié)合的Rossmann折疊超家族蛋白質(zhì), 屬于一個(gè)短鏈脫氫酶/還原酶家族 (short-chain dehydrogenase/reductase, SDR), 多數(shù)被鑒定的SDR被推斷為異黃酮還原酶、糖脫水酶和mRNA結(jié)合蛋白等。Baker等研究表明菠菜一個(gè)mRNA結(jié)合蛋白CSP41和核苷-糖異構(gòu)酶及羥類固醇脫氫酶同源[30]。CSP41是一類分子量為41 kD的葉綠體莖環(huán)結(jié)合蛋白, 目前已對(duì)多個(gè)物種的CSP41進(jìn)行了克隆和功能分析。最早報(bào)道的CSP41a在體外可以結(jié)合到mRNA的3￠末端, 具有序列特異的莖環(huán)結(jié)構(gòu)結(jié)合能力和核酸內(nèi)切酶活性[31]。隨后研究表明, CSP41蛋白也在質(zhì)體編碼的RNA PEP (plastid-encoded polymerase)或者質(zhì)體核糖體中存在, 可能參與RNA的轉(zhuǎn)錄或翻譯過(guò)程[32-33]。但最近的研究卻不能證實(shí)CSP41是PEP復(fù)合物的一部分[34]。研究表明CSP41缺乏已知的核酸內(nèi)切酶基序, 但屬于SDR超家族, 實(shí)驗(yàn)表明SDR基序可能是新類型的核酸內(nèi)切酶基序[35]。CSP41的蛋白功能具有多樣性, 并且已報(bào)道的CSP41蛋白均來(lái)自其他物種, 在水稻中尚無(wú)報(bào)道。水稻究竟行使以上的哪種或哪幾種功能, 還是其他的未知功能, 以及YGL6蛋白質(zhì)是否為CSP蛋白, 需要進(jìn)一步的相關(guān)實(shí)驗(yàn)探究。

4 結(jié)論

黃綠葉基因?yàn)? 與其他物種的葉綠體莖環(huán)結(jié)合蛋白聚類在一起。基因僅在綠色組織如心葉、成熟葉、葉鞘和綠色穎殼中表達(dá), 尤其以心葉的表達(dá)量最高, 其表達(dá)還受光照的誘導(dǎo)。YGL6蛋白被定位于葉綠體。我們認(rèn)為通過(guò)蛋白產(chǎn)物的RNA結(jié)合功能參與葉綠體的發(fā)育過(guò)程。本研究為進(jìn)一步研究的基因功能奠定了基礎(chǔ), 并豐富了水稻突變體庫(kù), 深化了當(dāng)前對(duì)葉綠體的發(fā)育過(guò)程的研究。

[1] Fromme P, Melkozernov A, Jordan P, Krauss N. Structure and function of photosystem I: interaction with its soluble electron carriers and external antenna systems., 2003, 555: 40–44

[2] Larkin R M, Alonso J M, Ecker J R, Chory J. GUN4, a regulator of chlorophyll synthesis and intracellular signaling., 2003, 299: 902–906

[3] Dong H, Fei G L, Wu CY, Wu F Q, Sun Y Y, Chen M J, Ren Y L, Zhou K N, Cheng Z J, Wang J L, Jiang L, Zhang X, Guo X P, Lei C L, Su N, Wang H Y, Wan J M. A ricemutant reveals new insights into the role and assembly of plastid caseinolytic protease in higher plants., 2013, 162: 1867–1880

[4] Yoo S, Cho S H, Sugimoto H, Li J, Kusumi K, Koh H J, Iba K, Paek N C. Riceandencoding the large and small subunits of ribonucleotide reductase are required for chloroplast biogenesis during early leaf development., 2009, 150: 388–401

[5] Kusumi K, Mizutani A, Nishimura M, Iba K. A virescent genedetermines the expression timing of plastid genes for transcription/translation apparatus during early leaf development in rice., 1997, 12: 1241–1250

[6] Kusumi K, Sakata C, Nakamura T, Kawasaki S, Yoshimura A, Iba K. A plastid protein NUS1 is essential for build-up of the genetic system for early chloroplast development under cold stress conditions., 2011, 68: 1039–1050

[7] Jung K H, Hur J, Ryu C H, Choi Y, Chung Y Y, Miyao A, Hirochika H, An G. Characterization of a rice chlorophyll-deficient mutant using the T-DNA gene-trap system., 2003, 44: 463–472

[8] Lee S, Kim J H, Enu S Y, Lee C H, Hirochika H, An G. Differential regulation of chlorophyll a oxygenase genes in rice., 2005, 57: 805–818

[9] Sugimoto H, Kusumi K, Tozawa Y, Yazaki J, Kishimoto N, Kikuchi S, Iba K. The virescent-2 mutation inhibits translation of plastid transcripts for the plastid genetic system at an early stage of chloroplast differentiation., 2004, 45: 985–996

[10] Sugimoto H, Kusumi K, Noguchi K, Yano M, Yoshimura A, Iba K. The rice nuclear gene,, is essential for chloroplast development and encodes a novel type of guanylate kinase targeted to plastids and mitochondria., 2007, 52: 512–527

[11] Zhang H, Li J J, Yoo J H, Yoo S C, Cho S H, Koh H J, Seo H S, Paek N C. Riceandencode ChlD and ChlI subunits of Mg-chelatase, a key enzyme for chlorophyll synthesis and chloroplast development., 2006, 62: 325–337

[12] Wu Z, Zhang X, He B, Diao L, Sheng S, Wang J, Guo X, Su N, Wang L, Jiang L, Wang C, Zhai H, Wan J. A chlorophyll deficient rice mutant with impaired chlorophyllide esterification in chlorophyll biosynthesis., 2007, 145: 29–40

[13] Koussevitzky S, Nott A, Mockler T C, Hong F. Signals from chloroplasts converge to regulate nuclear gene expression., 2007, 316: 715–719

[14] Terry M J, Kendrick R E. Feedback inhibition of chlorophyll synthesis in the phyochrome chromophore-deficient aurea andmutants of tomato., 1999, 119: 143–152

[15] Huq E, Al-Sady B, Hudson M. Phytochrome-interacting factor l is a critical bHLH regulator of chlorophyll biosynthesis., 2004, 305: 1937–1942

[16] Reinbothe S, Polhnann S, Springer A. A role of Toc33 in the protochlorophyllide-dependent plastid import pathway of NADPH: protochlorophyllide oxidoteductase ()., 2005, 42: 1–12

[17] Sergei K, Elena B, Sergei S A. Mutation of the mitochondrial ABC transporter Sta1 leads to dwarfism and chlorosis in the Arabidopsis mutant., 2001, 13: 89–100

[18] Shi J Q, Wang Y Q, Guo S, Ma L, Wang Z W, Zhu X Y, Sang X C, Ling Y H, Wang N, Zhao F M, He G H. Molecular mapping and candidate gene analysis of a() mutant in rice., 2015, 55: 669–680

[19] Ren D Y, Li Y F, Zhao F M, Sang X C, Shi J Q, Wang N, Guo S, Ling Y H, Zhang C W, Yang Z L, He G H., encoding an AP2/ERF protein, determines spikelet meristem fate and sterile lemma identity in rice., 2013, 162: 872–884

[20] Lichtenthaler H K. Chlorophylls and carotenoids: pigments of photosynthetic biomembranes., 1987, 48: 350–382

[21] Gothandarn K M, Kim E S, Cho H J, Chung Y Y.a pentatricopeptide tepeat protein office is essential for the chloroplast biogenesis,, 2005, 58: 421–433

[22] Kusumi K, Yara A, Mitsui N, Tozawa Y, Iba K. Characterization of a rice nuclear-encoded plastid RNA polymerase gene OsRpoTp., 2004, 45: 1194–1201

[23] Park S Y, Yu J W, Park J S, Li J, Yoo S C, Lee N Y, Lee S K, Jeong S W, Seo H S, Koh H J, Jeon J S, Park N C. The senescence-induced stay green protein regulates chloropgyll degradation., 2007, 19: 1649–1664

[24] Kusaba M, Ito H, Morita R, Iida S, Sato Y, Fujimoto M, Kawasaki S, Tanaka R, Hirpchika H, Nishimura M, Tanaka A. Riceis involved in light-harvesting complex II and grana degradation during leaf senescence., 2007, 19: 1362–1375

[25] Sato Y, Morita R, Katsuma S, Nishimura M, Tanaka A, Kusaba M. Two short-chain dehydrogenase/reductasesandare required for chlorophylland light-harvesting complex II degradation during senescence in rice., 2009, 57: 120–131

[26] Eberhard S, Loiselay C, Drapier D, Bujaldon S, Girard-Bascou J, Kuras R, Choquet Y, Wollman F A. Dual functions of the nucleus-encoded factor TDA1 in trapping and translation activation of atpA transcripts inchloroplasts., 2011, 67: 1055–1066

[27] Gottesman S, Storz G. Bacterial small RNA regulators: versatile roles and rapidly evolving variations., 2011, 3: 1–16

[28] Stern D B, Goldschmidt-Clermont M, Hanson M R. Chloroplast RNA metabolism., 2010, 61: 125–155

[29] Barkan A. Expression of plastid genes: organelle-specific elaborations on a prokaryotic scaffold., 2011, 155: 1520–1532

[30] Baker M E, Grundy W N, Elkan C P. Spinach CSP41, an mRNA-binding protein and ribonuclease, is homologous to nucleotide-sugar epimerases and hydroxysteroid dehydrogenases., 1998, 248: 250–254

[31] Yang J, Schuster G, Stern D B. CSP41, a sequence-specific chloroplast mRNA binding protein, is an endoribonuclease., 1996, 8: 1409–1420

[32] Pfannschmidt T, Ogrzewalla K, Baginsky S, Sickmann A, Meyer H E, Link G. The multisubunit chloroplast RNA polymerase A from mustard (L.). Integration of a prokaryotic core into a larger complex with organelle-specific functions., 2000, 267: 253–261

[33] Yamaguchi K, Beligni M V, Prieto S, Haynes P A, McDonald W H. Proteomic characterization of thechloroplast ribosome. Identification of proteins unique to the 70S ribosome., 2003, 278: 33774–33785

[34] Pfalz J, Bayraktar O A, Prikryl J, Barkan A. Site-specific binding of a PPR protein defines and stabilizes 5￠and 3￠mRNA termini in chloroplasts., 2009, 28: 2042–2052

[35] Bollenbach T J, Stern D B. Secondary structures common to chloroplast mRNA 3￠-untranslated regions direct cleavage by CSP41, an endoribonuclease belonging to the short chain dehydrogenase/reductase superfamily., 2003, 278: 25832–25838

Expression Pattern and Protein Localization of a() Gene in Rice ()

SHI Jun-Qiong1,2, WANG Ya-Qin1, ZHANG Tian-Quan1, MA Ling1, and HE Guang-Hua1,*

1Rice Research Institute, Chongqing Key Laboratory of Application and Safety Control of Genetically Modified Crops, Southwest University, Chongqing 400716, China;2School of Life Sciences, Southwest University, Chongqing 400716, China

Leaf color mutants are used not only as morphological markers in hybrid rice breeding, but also as ideal materials in studies on the structure and function of photosystem, chlorophyll biosynthesis and regulation mechanism. A new rice mutant exhibiting stable inheritance was derived from ethyl methane sulfonate (EMS)-treated restorer line Jinhui 10 (), tentatively named as(). Theleaf displayed yellow-green at seeding stage, and pale green at jointing stages. The YGL6complementation experiment implied that theis thegene. The expression pattern analysis indicated thatwas expressed in green tissues including young leaves, mature leaves, sheaths and green glume, with the highest expression level in young leaves. Andexpression was induced by light. Transient expression of theYGL6-GFP protein in rice protoplast showed that YGL6 was localized in chloroplasts. These results provide a foundation for functional analysis of.

rice ();();gene; chloroplast;expression pattern

2017-09-23;

2018-01-08;

2018-01-29.

10.3724/SP.J.1006.2018.00650

本研究由科技部重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2017YFD0100201), 重慶市科委項(xiàng)目(CSTCCXLJRC201713, cstc2016shms-ztzx0017)和中央高校基本業(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)(XDJK2016C111)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2017YFD0100201), Chongqing Science and Technology Commission Project (CSTCCXLJRC201713, cstc2016shms-ztzx0017), and the Fundamental Research Funds for the Central Universities (XDJK2016C111).

何光華, E-mail: hegh@swu.edu.cn

E-mail: shijunqiong@163.com

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20180126.1647.024.html