異養(yǎng)硝化－好氧反硝化菌的研究進(jìn)展

要如磊

（陽泉煤業(yè)（集團(tuán)）有限責(zé)任公司太原化工新材料有限公司,山西 太原 030400）

引 言

近年來,氮素污染所導(dǎo)致的水體富營(yíng)養(yǎng)化已經(jīng)引起了人們的廣泛關(guān)注,廢水脫氮研究尤為迫切。目前,生物脫氮工藝以其操作簡(jiǎn)單、成本低、二次污染小、脫氮效率高等多方面的優(yōu)點(diǎn),在國(guó)內(nèi)外污水處理中被廣泛應(yīng)用。傳統(tǒng)生物脫氮包括好氧條件下的自養(yǎng)硝化過程和厭氧條件下的異養(yǎng)反硝化過程,分別由硝化菌和反硝化菌完成。硝化反應(yīng)與反硝化反應(yīng)對(duì)溶解氧濃度需求的不同導(dǎo)致好氧區(qū)和缺氧區(qū)的分開,二者在反應(yīng)器上難以統(tǒng)一。

然而,隨著研究的深入,近年來人們發(fā)現(xiàn)有些脫氮微生物兼具異養(yǎng)硝化和好氧反硝化的功能,異養(yǎng)硝化－好氧反硝化菌成為生物脫氮領(lǐng)域內(nèi)的一個(gè)新的熱點(diǎn)。這些新型脫氮微生物可以使硝化和反硝化反應(yīng)能在同一反應(yīng)器內(nèi)同時(shí)完成,節(jié)省了反應(yīng)空間,縮短了反應(yīng)時(shí)間,平衡了反應(yīng)條件,還克服了傳統(tǒng)生物脫氮存在的很多弊端。

1 異養(yǎng)硝化－好氧反硝化菌的類型

1983年,荷蘭Robertson和Kuenen最早從脫硫脫氮污水處理系統(tǒng)中分離出一株泛養(yǎng)硫球菌thiosphaera pantotropha（后更名為脫氮副球菌paracoccus denitrificans）,隨后發(fā)現(xiàn)它能同時(shí)進(jìn)行異養(yǎng)硝化和好氧反硝化,其功能的特殊性吸引了國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)異養(yǎng)硝化－好氧反硝化菌廣泛而深入的研究。

1989年,Robertson和Cornelisse對(duì)delft菌種保藏庫(kù)中某些異養(yǎng)硝化菌是否為好氧反硝化菌進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,具有異養(yǎng)硝化功能的脫氮假單胞桿菌pseudomonas denitrificans和糞產(chǎn)堿桿菌alcaligenes faecalis也具有好氧反硝化功能。

近十幾年來,國(guó)內(nèi)外學(xué)者積極研究,新的異養(yǎng)硝化－好氧反硝化菌不斷被發(fā)現(xiàn),大大拓寬了雙功能菌的種類。異養(yǎng)硝化－好氧反硝化菌主要存在于副球菌屬（paracoccus）、假單胞菌屬（pseudomonas）、產(chǎn)堿桿菌屬（alcaligenes）、芽孢桿菌屬（bacillus）、紅球菌屬（rhodococcuus）等（見第33頁表1）。

2 異養(yǎng)硝化－好氧反硝化菌的篩選方法

2.1 選擇性培養(yǎng)基法

利用不同氮源的選擇性培養(yǎng)基可以用來篩選異養(yǎng)硝化－好氧反硝化菌。首先,通過氨氮培養(yǎng)基初篩得到異養(yǎng)硝化菌,挑選氨氮去除能力較高的菌株；然后,將其接種于硝酸氮培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)篩,最終得到異養(yǎng)硝化－好氧反硝化菌。Zhang［1］等先用硝化基礎(chǔ)培養(yǎng)基富集、分離、純化得到異養(yǎng)硝化菌,然后用反硝化培養(yǎng)基篩選出能利用NO－3、NO－2的菌株,從豬糞廢水中篩選得到Y(jié)ZN－001菌株。此菌株不僅能利用氨氮,而且能利用硝酸氮。

2.2 酸堿指示劑法

溴百里酚藍(lán)（BTB）指示劑的變色范圍為6.0～7.6,由黃色經(jīng)綠色變?yōu)樗{(lán)色。而反硝化作用消耗硝酸鹽或亞硝酸鹽后,OH－不斷積累,根據(jù)反硝化過程產(chǎn)堿這一特性在反硝化培養(yǎng)基中加入BTB,篩選平板上出現(xiàn)藍(lán)色暈圈的菌落,即可實(shí)現(xiàn)好氧反硝化菌的初步篩選。尹明銳［2］等利用BTB培養(yǎng)基分離得到好氧反硝化菌,進(jìn)一步通過硝化測(cè)定,選取氨氮去除率在50%以上的菌株,確認(rèn)得到3株異養(yǎng)硝化－好氧反硝化菌。

表1 新型異養(yǎng)硝化－好氧反硝化菌

而另一些研究者同樣利用溴百里酚藍(lán)指示劑的變色特點(diǎn),先篩選得到異養(yǎng)硝化菌,進(jìn)一步接種于含有1%BTB的反硝化培養(yǎng)基,能使培養(yǎng)基變藍(lán),并且杜氏小管中有氣泡生成的菌株同時(shí)具有好氧反硝化作用。

2.3 滴加試劑法

格里斯試劑遇會(huì)變紅,二苯胺試劑遇會(huì)變藍(lán),納氏試劑遇會(huì)變紅,該方法利用顯色反應(yīng)篩選出目標(biāo)菌。培養(yǎng)一段時(shí)間后,在硝化培養(yǎng)液中加入1滴～2滴格里斯試劑,如溶液立即呈粉紅色或棕色等,則表示氨氮轉(zhuǎn)化為亞硝酸氮,說明培養(yǎng)液中有硝化菌存在；進(jìn)一步加入納氏試劑,培養(yǎng)液為無色,則表示氨氮轉(zhuǎn)化完全。同上方法,滴加格里斯試劑檢測(cè)反硝化培養(yǎng)液中是否有反硝化菌；進(jìn)一步加入二苯胺試劑,若無色,則表示硝酸鹽轉(zhuǎn)化完全。蔣靜艷［3］等以乙酰胺為唯一碳氮源進(jìn)行培養(yǎng)得到初篩菌,用格里斯試劑和二苯胺試劑驗(yàn)證是否為硝化菌。袁夢(mèng)冬［4］等將篩選得到的異養(yǎng)硝化菌接種至硝酸鹽還原培養(yǎng)基中,連續(xù)3d取樣滴加二苯胺試劑、格里斯試劑、納氏試劑,菌株的硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)呈陽性,初步斷定該菌株同時(shí)具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化作用。

2.4 測(cè)試驗(yàn)證法

另外,研究者還可以對(duì)已獲得的菌株進(jìn)行硝化或反硝化能力測(cè)試,驗(yàn)證其是否為異養(yǎng)硝化－好氧反硝化菌。Hung－Soo Joo［5］等對(duì)從污水中分離得到的異養(yǎng)硝化菌alcaligenes faecalis No.4進(jìn)行探究,結(jié)果表明,被去除的氨氮中50%發(fā)生了反硝化,其既有硝化功能,也有反硝化功能。Joong Kyun Kim［6］等對(duì)24株芽孢桿菌經(jīng)過異養(yǎng)硝化、好氧反硝化驗(yàn)證,最終篩選出5株具有好氧反硝化功能的異養(yǎng)硝化菌。

選擇性培養(yǎng)基法篩選菌株準(zhǔn)確,但涉及多次涂板、劃線,工作量大,篩選時(shí)間長(zhǎng)；酸堿指示劑法篩選菌株準(zhǔn)確,顏色變化明顯,操作方法簡(jiǎn)單,分離快速高效；滴加試劑法篩選方法不準(zhǔn)確,因?yàn)檎麄€(gè)硝化、反硝化過程中、的積累量較少或沒有,加入格里斯試劑和二苯胺試劑呈陰性反應(yīng),并不能說明該菌株不具有硝化能力,容易漏篩目標(biāo)菌；測(cè)試驗(yàn)證法適合驗(yàn)證某種已獲得菌株是否具有硝化、反硝化功能,并不適合異養(yǎng)硝化－好氧反硝化菌的直接篩選。

3 異養(yǎng)硝化－好氧反硝化菌的脫氮性能

目前,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的異養(yǎng)硝化－好氧反硝化菌的脫氮性能較高。Taylor Shauna M［7］等從膜生物反應(yīng)器中篩選得到一株雷氏普羅威登斯菌providencia rettgeri YL,在最優(yōu)條件（C/N 10,30℃,120r/min）下,當(dāng)氨氮質(zhì)量濃度為84.63mg/L時(shí),接種該菌48h后TN（總氮）去除率為79%。Zhao Bin［8］等對(duì)異養(yǎng)硝化－好氧反硝化菌bacillus sp.LY進(jìn)行好氧脫氮性能研究。結(jié)果表明,在C/N 15、30℃最優(yōu)條件下,當(dāng)初始氨氮質(zhì)量濃度為40mg/L時(shí),最大氨氮去除效率可達(dá)到100%,TN去除效率可達(dá)78.9%。

大量研究表明,異養(yǎng)硝化－好氧反硝化菌在轉(zhuǎn)化氨氮為氣態(tài)氮化物的同時(shí),還利用氮源發(fā)生同化作用,轉(zhuǎn)化為菌株細(xì)胞內(nèi)的含氮有機(jī)化合物。Hung－Soo Joo 等 研 究 高 濃 度 氨 氮 下 alcaligenes faecalis No.4的脫氮效率,當(dāng)初始質(zhì)量濃度高達(dá)1 200mg/L時(shí),接種菌株93h后,幾乎所有氨氮被去除。其中,50%轉(zhuǎn)化為細(xì)胞內(nèi)含氮物質(zhì),3%轉(zhuǎn)化為硝化產(chǎn)物,40%～50%發(fā)生反硝化作用。GC－MS證明90%的反硝化產(chǎn)物為氮?dú)狻hen Qian［8］等對(duì)農(nóng)桿菌agrobacterium sp.LAD9在異養(yǎng)硝化－好氧反硝化過程中的氮平衡進(jìn)行研究,TN初始質(zhì)量濃度為97.19mg/L。接種該菌24h后,50.1%的 TN被轉(zhuǎn)化為氣態(tài)氮化物,40.8%的TN轉(zhuǎn)化為生物量。由此可見,異養(yǎng)硝化－好氧反硝化菌的生物同化作用成為限制總氮去除率的一個(gè)主要原因。

4 總結(jié)與展望

綜上所述,異養(yǎng)硝化－好氧反硝化菌的屬種范圍逐步擴(kuò)大,篩選方法日益成熟,脫氮效率可達(dá)到50%～80%。新型異養(yǎng)硝化－好氧反硝化菌能利用多種無機(jī)氮源,減少反應(yīng)器數(shù)量,減小外加堿量,降低成本,在污水處理方面應(yīng)用前景廣泛。但是,異養(yǎng)硝化－好氧反硝化菌的總氮去除效率仍然較低,將菌株固定化、提高微生物濃度、實(shí)現(xiàn)菌種的固液分離和回收,對(duì)提高脫氮效率有非常重要的意義。

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