尿石素B對(duì)地塞米松誘導(dǎo)小鼠肌萎縮的改善作用及機(jī)制

王叢叢 李 軍 魯飛翔 呂裕霞 劉慶春

(錦州醫(yī)科大學(xué)武警總醫(yī)院聯(lián)合培養(yǎng)基地，北京 100039)

肌肉減少綜合征(簡(jiǎn)稱肌少癥)是一種隨著年齡增加，表現(xiàn)出的以肌肉質(zhì)量、力量和功能減退的一種身體狀態(tài)〔1〕，直至2016年被正式納入到ICD-10疾病編碼中，標(biāo)志著醫(yī)界正式將其視作一種有獨(dú)特特征的疾病。一項(xiàng)在中國(guó)社區(qū)老人中的調(diào)查顯示，按照亞洲診斷標(biāo)準(zhǔn)，60歲以上的男、女性肌少癥患病率分別為8.2%、12.5%〔2〕，而肌少癥是一系列不良結(jié)果的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，如影響生活質(zhì)量，增加跌倒風(fēng)險(xiǎn)，住院天數(shù)延長(zhǎng)或?qū)Χ喾N疾病的預(yù)后有不良影響。目前，肌少癥主要有效的預(yù)防措施是增加優(yōu)質(zhì)蛋白質(zhì)的攝入(1.0～1.2 g·kg-1·d-1)和加強(qiáng)運(yùn)動(dòng)，尚無(wú)有效的藥物治療措施〔3〕。有研究表明，經(jīng)常攝入富含鞣酸和鞣花單寧的漿果及堅(jiān)果對(duì)人體健康大有裨益，有抗腫瘤、抗菌抗炎、心血管代謝、抗氧化、保護(hù)神經(jīng)等作用，但是鞣酸本身不易被小腸吸收，很難發(fā)揮作用〔4〕。Seeram等〔5〕發(fā)現(xiàn)鞣酸單寧在腸道的代謝產(chǎn)物尿石素A、B普遍存在于體液中，且進(jìn)食富含鞣酸單寧的食物可以緩解應(yīng)激期的肌肉損害〔6〕及高脂膳食對(duì)肌肉質(zhì)量的影響〔7〕。因此尿石素可能對(duì)肌少癥有潛在的治療作用。本文通過(guò)地塞米松誘導(dǎo)的肌少癥模型來(lái)研究尿石素對(duì)肌少癥的作用，并探討可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、藥物與試劑及儀器 昆明鼠，雄性，32只，SPF級(jí)，5～6周齡，體重28.70～34.32 g，購(gòu)于軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，合格證號(hào)：SCXK-(軍)2012-0004。飼養(yǎng)條件：室溫(21.5±2.0)℃，相對(duì)濕度(50±5)%，12/12 h照明節(jié)律，自由進(jìn)食、飲水。地塞米松(國(guó)藥集團(tuán)榮生制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H41020036)購(gòu)自武警總醫(yī)院，尿石素B購(gòu)于上海詩(shī)丹德有限公司，組織RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、PCR擴(kuò)增試劑盒購(gòu)于艾德萊有限公司，PCR引物由上海生工有限公司合成。FA1004型電子天平，Echo MRITM小動(dòng)物體成分分析儀，YLS-13A大小鼠抓力儀，英國(guó)Picdrop公司超微量分光光度計(jì)，DYY-6D型電泳儀，美國(guó)ABI2720型PCR儀，德國(guó)QIAGEN Rotor-Gene Q實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

1.2動(dòng)物分組及給藥 適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，采用系統(tǒng)隨機(jī)抽樣法將小鼠分組：①正常組；②模型組，每組16只動(dòng)物，模型組按照10 mg·kg-1·d-1地塞米松注射液皮下注射，正常組16只給予對(duì)應(yīng)體重的生理鹽皮下注射。待確定模型成功后，各組內(nèi)分為兩個(gè)亞組，分別給予灌胃生理鹽水和50 mg·kg-1·d-1尿石素B。共有正常組，正常給藥組，模型組，模型給藥組。

1.3小鼠體重及體成分測(cè)定 小鼠每天測(cè)體重，按體重給藥。1 w進(jìn)行1次體成分測(cè)試。即準(zhǔn)確稱量體重后，直接把未麻醉的小鼠放置在一定大小的透明塑料動(dòng)物艙內(nèi)，然后將動(dòng)物艙插入Echo MRITM 側(cè)面的管狀空間，通過(guò)儀器專用的控制和分析軟件進(jìn)行掃描，測(cè)量得到小鼠的瘦體重、脂肪、自由水和總水含量。其中測(cè)量得到的瘦體重含量能直接反映小鼠的整體肌肉量。

1.4小鼠抓力測(cè)定 使用YLS-13A大小鼠抓力儀，測(cè)試前讓小鼠在抓力儀上適應(yīng)10 min，然后抓住小鼠尾巴，確定小鼠抓牢后，平穩(wěn)的向后拉，記錄儀器上抓力讀書。測(cè)定三次并記錄結(jié)果，用最大抓力作為反映肌肉力量的指標(biāo)。

1.5小鼠腓腸肌蘇木素-伊紅(HE) 造模結(jié)束后，處死小鼠，分離小鼠兩側(cè)腓腸肌。左側(cè)腓腸肌浸入4%多聚甲醛中固定，用于制作石蠟切片。HE染色后，采用LEICA圖像采集系統(tǒng)選取4個(gè)視野進(jìn)行拍片，放大倍數(shù)為200倍。每個(gè)視野選取10個(gè)肌纖維，應(yīng)用Image J軟件計(jì)算出每個(gè)肌纖維的橫截面積。

1.6RT-PCR檢測(cè)MyoD、MyoG、MuRF-1、Atrogin mRNA表達(dá) 取右下肢腓腸肌組織放入無(wú)菌Eppendorf管中，加液氮研磨。按照RNA提取試劑盒說(shuō)明，進(jìn)行組織RNA的提取。并對(duì)提取RNA濃度及純度進(jìn)行測(cè)定，并在反轉(zhuǎn)錄過(guò)程中將RNA的濃度調(diào)整一致，達(dá)到1 000 ng。按照TUREscript 1st Strand cDNA Synthsis Kit、2×SYBR Green qPCR Mix說(shuō)明書進(jìn)行RT-PCR。以GAPDH作為內(nèi)參基因，正常組基因表達(dá)量作為標(biāo)準(zhǔn)，運(yùn)用2-△△Ct法，計(jì)算各組中基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析、LSD及DunnettT3法檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠體重及體成分比較 造模結(jié)束時(shí)，模型給藥組死亡2例，其余均正常。正常組與正常給藥組小鼠穩(wěn)定體重增加。與正常組比較，模型組及模型給藥組體重明顯下降，脂肪比重明顯增加，筋肉比重明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組與模型組給藥組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

表1 小鼠體重及體成分改變

與正常組比較：1)P<0.05

2.2各組小鼠最大抓力比較 與正常組、正常給藥組最大抓力〔(395.8±78.0)g、(351.0±33.3)g〕相比，模型組與模型給藥組最大抓力均明顯下降，分別為(257.0±27.3)g、(280.4±40.6)g，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。正常組、正常給藥組兩組與模型組、模型給藥兩組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=12.809，P=0.000)，但兩組內(nèi)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。雖然模型給藥組與模型組最大抓力差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.772)，但給藥后最大抓力有增加的趨勢(shì)。

2.3各組腓腸肌橫截面面積比較 與正常組肌肉的橫截面積〔(537.77±56.08)μm2〕相比，正常給藥組面積稍下降〔(507.82±45.03)μm2〕，但兩組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.259)。模型組〔(283.39±34.12)μm2〕較正常組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型給藥組肌纖維橫截面積則有所上升，為(396.50±40.97)μm2，模型組與模型給藥組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，但模型給藥組與正常組和正常給藥組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見圖1。

圖1 各組小鼠腓腸肌肌纖維橫截面積(HE，×200)

2.4肌肉中相關(guān)基因mRNA比較 與正常組MyoD、MyoG mRNA表達(dá)水平比較，正常給藥組MyoD、MyoG mRNA表達(dá)水平分別是正常組1.26，1.24倍，組內(nèi)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組與模型給藥組則表現(xiàn)出明顯降低，模型組MyoD、MyoG表達(dá)水平分別為正常組的0.35、0.24倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，模型給藥組分別是正常組的0.60、0.87倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型組MuRF-1與Atrogin mRNA表達(dá)水平是正常組的17.66、11.01倍，模型給藥組MuRF-1、Atrogin mRNA則是正常組的4.23、4.05倍，表達(dá)水平較模型組明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3 討 論

肌少癥是增齡相關(guān)性疾病，隨著年齡的增長(zhǎng)發(fā)病率也是逐漸增加的〔8〕。增齡不僅會(huì)引起骨骼肌質(zhì)量的改變，同時(shí)也會(huì)使激素水平改變、能量蛋白質(zhì)攝入減少、消化吸收功能下降、營(yíng)養(yǎng)代謝水平下降、神經(jīng)-肌肉功能衰退及線粒體、染色體損傷、炎性因子與自由基氧化損傷、細(xì)胞凋亡等的改變，這些均可能是影響肌少癥發(fā)生的因素〔9〕。其中，增齡性的糖皮質(zhì)激素水平異常升高與骨骼肌萎縮呈正相關(guān)，且增齡性的肌少癥與地塞米松誘導(dǎo)的肌少癥在一定程度上都呈現(xiàn)肌肉質(zhì)量減少，肌力下降，肌纖維蛋白合成減少、分解加快的狀態(tài)，且使肌纖維失去再生能力，兩者的狀態(tài)相似〔10〕。研究顯示，糖皮質(zhì)激素增加蛋白質(zhì)的降解，主要是通過(guò)降低PI3K/Akt信號(hào)通路中一些基因的表達(dá)，如MyoG、MyoD，減少蛋白質(zhì)的合成，同時(shí)激活泛素-蛋白酶體通路(UPS)和溶酶體自噬系統(tǒng)〔11〕，UPS系統(tǒng)中的泛素活性增加和泛素連接酶水平上升，使蛋白質(zhì)降解增強(qiáng)，從而造成肌肉萎縮的，其中MuRF-1和Atrogin是UPS通路中的關(guān)鍵因素。

尿石素B主要是石榴、葡萄漿果類與堅(jiān)果如核桃等的代謝產(chǎn)物鞣酸、鞣花單寧在腸道菌群的作用下，產(chǎn)生的系列產(chǎn)物中的一種，包括有尿石素A、B、C、D等，尿石素B是最終產(chǎn)物〔12〕。但由于人體腸道菌群的差異，體內(nèi)尿石素的含量也存在很大的差異〔13〕。有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示，尿石素對(duì)健康是有益處的，不僅有抗炎的作用〔14〕，也能夠維持和提高線粒體及肌肉的功能的作用〔15〕。直接補(bǔ)充尿石素可能是將其作用發(fā)揮到最大的一種有效措施。Mena等〔16〕在模擬人體消化系統(tǒng)對(duì)尿石素進(jìn)行研究，表明經(jīng)口攝入尿石素可以穩(wěn)定發(fā)揮作用。另外，Heilman等〔17〕對(duì)尿石素A進(jìn)行了安全性評(píng)估，在急慢性毒理試驗(yàn)中，均表明按照體重的5%在食物中添加尿石素不會(huì)對(duì)人體產(chǎn)生危害，這也為我們的試驗(yàn)提供了依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)采用魯飛翔等〔18〕方法并進(jìn)行改進(jìn)，建立地塞米松誘導(dǎo)的小鼠肌少癥模型，研究灌胃給予尿石素B對(duì)于地塞米松誘導(dǎo)的小鼠肌萎縮模型的影響。與以往研究結(jié)果一致〔19〕，本研究結(jié)果顯示尿石素B能夠改善地塞米松誘導(dǎo)的小鼠肌萎縮模型，有增加肌肉質(zhì)量和力量的趨勢(shì)，其機(jī)制主要是通過(guò)抑制泛素蛋白酶通路中的MuRF-1和Atrogin的表達(dá)，減輕肌蛋白的降解，同時(shí)上調(diào) PI3K/Akt信號(hào)通路中MyoD和MyoG的表達(dá)水平，增加肌蛋白合成速率。

1Cruzjentoft AJ,Baeyens JP,Bauer JM,etal.Sarcopenia:European consensus on definition and diagnosis.Report of the European Working Group on Sarcopenia in Older People〔J〕.Age Ageing,2010;39(4):412-23.

2Hui W,Shan H,Li C,etal.Estimation of prevalence of sarcopenia by using a new bioelectrical impedance analysis in Chinese community-dwelling elderly people〔J〕.BMC Geriatrics,2016;16(1):216.

3Naseeb MA,Volpe SL.Protein and exercise in the prevention of sarcopenia and aging〔J〕.Nutr Res,2017;40:1.

4Garciamuoz C,Vaillant F.Metabolic fate of ellagitannins:implications for health,and research perspectives for innovative functional foods〔J〕.Crit Rev Food Sci Nutr,2014;54(12):1584-98.

5Seeram NP,Henning SM,Zhang Y,etal.Pomegranate juice ellagitannin metabolites are present in human plasma and some persist in urine for up to 48 hours〔J〕.J Nutr,2006;136(10):2481.

6Trombold JR,Barnes JN,Critchley L,etal.Ellagitannin consumption improves strength recovery 2-3 d after eccentric exercise〔J〕.Med Sci Sports Exer,2010;42(3):493.

7Rodriguez J,Gilson H.Pomegranate and green tea extracts protect against ER stress induced by a high-fat diet in skeletal muscle of mice〔J〕.Eur J Nutr,2015;54(3):377-89.

8程 群,鄭麗麗,章振林.肌少癥流行病學(xué)及發(fā)病機(jī)制〔J〕.中華骨質(zhì)疏松和骨礦鹽疾病雜志,2016;9(3):228-35.

9Harman D.The aging process〔J〕.Proceed Nat Acad Sci U S A,1981;78(11):7124.

10Kaasik P,Umnova M,Pehme A,etal.Ageing and dexamethasone associated sarcopenia:peculiarities of regeneration〔J〕.J Steroid Biochem Molec Biol,2007;105(1-5):85-90.

11Bodine SC,Furlow JD.Glucocorticoids and skeletal muscle〔J〕.Adv Exp Med Biol,2015;872:145.

12Selma MV,Beltrán D,García-Villalba R,etal.Description of urolithin production capacity from ellagic acid of two human intestinal Gordonibacter species〔J〕.Food Func,2014;5(8):1779.

13Pfundstein B,Haubner R,Würtele G,etal.Pilot Walnut intervention study of urolithin bioavailability in human volunteers〔J〕.J Agri Food Chem,2014;62(42):10264-73.

14Tomásbarberán FA,Garcíavillalba R,Gonzálezsarrías A,etal.Ellagic acid metabolism by human gut microbiota:consistent observation of three urolithin phenotypes in intervention trials,independent of food source,age,and health status〔J〕.J Agri Food Chem,2014;62(28):6535.

15Ryu D,Mouchiroud L,Andreux PA,etal.Urolithin A induces mitophagy and prolongs lifespan in C.elegans and increases muscle function in rodents〔J〕.Nature Med,2016;22(8):879.

16Mena P,Dall'Asta M,Calani L,etal.Gastrointestinal stability of urolithins:an in vitro approach.〔J〕.Eur J Nutr,2017;56(1):99.

17Heilman J,Andreux P,Tran N,etal.Safety assessment of Urolithin A,a metabolite produced by the human gut microbiota upon dietary intake of plant derived ellagitannins and ellagic acid〔J〕.Food Chem Toxicol,2017;108:289-97.

18魯飛翔,李 軍,周仙杰,等.地塞米松致小鼠肌肉衰減綜合征模型建立〔J〕.中國(guó)老年學(xué)雜志,2016;36(22):5542-4.

19Rodriguez J,Pierre N,Naslain D,etal.Urolithin B,a newly identified regulator of skeletal muscle mass〔J〕.J Cachexia Sarcopenia Muscle,2017;8(4)：567-82.