兩種不同方法建立乳鼠神經(jīng)細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型

劉 威 王 爽 溫 娜 王洪羽 萬(wàn)曉明 金 宏

(吉林醫(yī)藥學(xué)院臨床技能實(shí)驗(yàn)室，吉林 吉林 132001)

目前缺血缺氧性腦病基本治療原則是恢復(fù)血流再通，常用的治療方法有溶栓、介入等〔1〕。但缺氧的腦組織在恢復(fù)血流灌注的同時(shí)卻往往損傷程度加重，形成缺氧/復(fù)氧損傷，這是臨床上最常見(jiàn)的腦血管疾病的病理過(guò)程之一，可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞的直接或間接死亡，對(duì)患者預(yù)后產(chǎn)生不良影響，使其生活質(zhì)量下降。目前利用藥物減輕氧化應(yīng)激反應(yīng)的研究成為熱點(diǎn)，建立簡(jiǎn)便、穩(wěn)定的神經(jīng)細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷模型是開(kāi)展藥物研究的前提。本實(shí)驗(yàn)采用兩種常見(jiàn)的導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷藥物：過(guò)氧化氫(H2O2)和氯化鈷(CoCl2)，分別作用于乳鼠原代提取神經(jīng)細(xì)胞，分析其在建立缺氧/復(fù)氧損傷模型方面的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 DMEMF12培養(yǎng)液為美國(guó)Gibco公司產(chǎn)品；MTT、胰蛋白酶為美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；新生牛血清為四季青公司產(chǎn)品；二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自日本SANYO公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) 取新生72 h內(nèi)的SD大鼠乳鼠3～4只，剪取腦組織，冰面上平皿中磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗3次，置于大離心管中剪碎，PBS液沖洗2次，以0.25%胰蛋白酶反復(fù)消化，直至組織塊消失。收集液以200目濾網(wǎng)過(guò)濾，離心重懸后調(diào)整密度為105～106ml-1接種于細(xì)胞培養(yǎng)板中，96孔板每孔200 μl。

1.3實(shí)驗(yàn)分組及濃度處理 待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)良好時(shí)分組，空白組無(wú)處理因素繼續(xù)培養(yǎng)，H2O2組加入H2O2終濃度為200、400、600、800、1 000 μmol/L的培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)50 min、2 h、3 h后換正常培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)18 h，不同濃度不同時(shí)間設(shè)3個(gè)復(fù)孔。CoCl2組分別加入CoCl2終濃度為100、200、300、400、500 μmol/L的無(wú)血清培養(yǎng)基，每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)20 h后換正常培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率 培養(yǎng)結(jié)束后各組神經(jīng)細(xì)胞以PBS清洗2次，加入無(wú)血清培養(yǎng)液及20 μl MTT溶液，37℃培養(yǎng)4 h。棄上清后每孔加入150 μl二甲基亞砜，震板10 min，酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定吸光度(A)值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和配對(duì)t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1H2O2致大鼠乳鼠神經(jīng)細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷結(jié)果 H2O2引起神經(jīng)細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷程度與劑量和時(shí)間呈正比，劑量越大，處理時(shí)間越長(zhǎng)，細(xì)胞的損傷越明顯，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見(jiàn)表1。其中600、800 μmol/L作用于神經(jīng)細(xì)胞缺氧3 h，復(fù)氧24 h效果較好，細(xì)胞存活率在50%～60%，宜選擇該濃度和時(shí)間建立缺氧/復(fù)氧損傷模型。

表1 不同濃度H2O2作用不同時(shí)間對(duì)神經(jīng)細(xì)胞存活率的影響

與空白組比較：1)P<0.05

2.2不同濃度CoCl2致大鼠乳鼠神經(jīng)細(xì)胞缺氧復(fù)氧損傷結(jié)果 不同濃度 CoCl2作用于神經(jīng)細(xì)胞24 h可導(dǎo)致細(xì)胞存活率明顯下降，與空白組〔(100.00±0.00)%〕相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，其損傷程度隨CoCl2濃度增加而增強(qiáng)，100、200、300、400、500 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率分別為(84.56±3.17)%、(80.29±41.02)%、(59.78±2.69)%、(51.59±3.06)%、(34.66±2.32)%,其中300、400 μmol/L作用24 h效果較好，可選擇該濃度造模。

3 討 論

缺血缺氧性腦病是臨床上常見(jiàn)的一種疾病，各種腦血管意外是其常見(jiàn)病因，減輕治療過(guò)程中產(chǎn)生的缺血再灌注損傷成為近年來(lái)成為研究的熱點(diǎn)。目前研究多采用體外培養(yǎng)細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，利用物理或化學(xué)方法建立缺氧損傷模型。物理方法多是利用含有氮?dú)獾娜龤馀囵B(yǎng)箱，或利用氮?dú)饷芊怏w外培養(yǎng)細(xì)胞，造價(jià)昂貴，操作復(fù)雜，效果不穩(wěn)定。相比之下利用化學(xué)藥物誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧簡(jiǎn)便易行，重現(xiàn)性好。本研究采用了兩種常用的氧化劑H2O2和 CoCl2作用于乳鼠神經(jīng)細(xì)胞引起細(xì)胞氧化損傷。細(xì)胞的氧化損傷主要是由反應(yīng)活性氧(ROS)引起的，它介導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷與各種心腦血管疾病的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)〔2〕。ROS種類(lèi)多樣，H2O2是其中一種主要形式，它易于穿過(guò)細(xì)胞膜，在短期內(nèi)引發(fā)細(xì)胞產(chǎn)生各種ROS；ROS在細(xì)胞內(nèi)積聚，迅速引起細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)過(guò)氧化，細(xì)胞功能紊亂，膜通透性增加甚至死亡〔3〕。本研究表明H2O2對(duì)細(xì)胞作用迅速，誘導(dǎo)缺氧效果顯著，該效果在一定范圍內(nèi)與濃度呈正比。與H2O2相CoCl2作用神經(jīng)細(xì)胞后往往引起缺氧過(guò)程較緩慢，有研究表明〔4〕利用CoCl2建立的鼠腦缺氧模型可用于研究細(xì)胞內(nèi)相關(guān)酶，蛋白及細(xì)胞因子在缺氧損傷過(guò)程中的作用機(jī)制，其機(jī)制主要是Co2+可進(jìn)入細(xì)胞并置換催化酶上的Fe2+導(dǎo)致酶失效〔5〕。另外也可使抑制引起細(xì)胞缺氧損傷的缺氧誘導(dǎo)因子(HIF)-1降解，從而誘發(fā)細(xì)胞缺氧損傷〔6〕。這些研究表明Co2+在造模機(jī)制上更符合慢性缺氧的特點(diǎn)，不僅僅可以成功模擬缺氧狀態(tài)，還可以模擬缺氧的病理過(guò)程。本研究表明CoCl2可誘導(dǎo)原代提取神經(jīng)細(xì)胞的缺氧損傷，其嚴(yán)重程度與濃度在一定范圍內(nèi)呈正比?？傊?，H2O2和CoCl2這兩種氧化劑均可導(dǎo)致細(xì)胞氧化損傷，效果確切，且實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ鸵子诮ⅲ貜?fù)性好，但誘導(dǎo)細(xì)胞缺氧時(shí)間不同，可根據(jù)實(shí)驗(yàn)要求選擇其中一種造模，以研究藥物對(duì)缺氧性疾病的作用機(jī)制。

1Roger VL,Go AS,Llo YD JM,etal.Heart disease and stroke statistics-2011 update:a report from the American Heart Association〔J〕.Circulation,2011;123(4):e18-e29.

2Nourazarian AR,Kangari P,Salmaninejad A.Roles oxidative stress in the development and progression of breast cancer〔J〕.Asian Pac J Cancer Prev,2014;15(12):4745-51.

3陳剛領(lǐng),鄭建普,李亞娟.H2O2氧化損傷血管內(nèi)皮模型的構(gòu)建及超氧化物歧化酶對(duì)損傷的逆轉(zhuǎn)作用〔J〕.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào),2009;25(7):884-7.

4Rani A,Prasad S.CoCl2induced biochemical hypoxia down regulates activities and expression of super oxide dismutase and catalase in cerebral cortex of mice〔J〕.Neurochem Res,2014;39:1787-96.

5Ohtomo S,Nangaku M,Lzuhara Y,etal.Cobalt ameliorates renal injury in an obese hypertensive type 2 diabetes rat model〔J〕.Nephrol Dial Transplant,2008;23(4):1166-72.

6Gilkes DM，Semenza GL,Wirtz D.Hypoxia and the extracellular matrix:drivers of tumour metastasis〔J〕.Nat Rev Cancer,2014;14(6):430-9.