參附注射液對多柔比星致心肌病大鼠心肌組織轉(zhuǎn)化生長因子-β1和Smad3 蛋白表達(dá)的影響

張志剛 刁墨芝 常文華 陳 菲 孫國棟 劉 磊 侯曉青 姬海榮

(聊城市人民醫(yī)院藥學(xué)部，山東 聊城 252000)

心肌病主要特征為心室功能不全和心肌纖維化〔1，2〕，其發(fā)病原因復(fù)雜，其中轉(zhuǎn)化生長因子(TGF)-β1/Smad3信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路被證明與心肌病心肌纖維化發(fā)生機(jī)制關(guān)系密切〔3〕。附子是毛茛科植物烏頭(Aconitum carmichaelii)的子根，因附于烏頭而得名。性味甘，“入心、肝、腎三經(jīng)”，常用于回陽救逆，補(bǔ)火助陽，逐寒去濕。參附注射液由紅參、附片中提取的有效成分精制而成，主要含人參皂甙、水溶性生物堿等，具有廣泛藥理作用，能清除氧自由基、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、改善心功能、降低血液黏度、改善血流變學(xué)等〔4〕。課題組前期已證明參附注射液可以通過抑制多柔比星引起的心肌細(xì)胞凋亡從而保護(hù)心肌〔5〕，本文觀察多柔比星所致心肌病大鼠心肌纖維化的改變及心肌組織TGF-β1及Smad3蛋白表達(dá)的變化，研究參附注射液對心肌病大鼠心肌纖維化的保護(hù)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1動(dòng)物、藥品、試劑及儀器 SD大鼠90只，清潔級，雌雄各半，體質(zhì)量(150±15)g，由聊城市藥品檢驗(yàn)所提供〔許可證號：SYXK(魯)2013 0009〕。參附注射液(四川雅安三九藥業(yè)有限公司，批號：Z2009-3117，規(guī)格：10 ml/支，注射用鹽酸多柔比星(浙江海正藥業(yè)股份有限公司，批號：130702，規(guī)格：10 mg/瓶)。酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)試劑盒、兔抗TGF-β1、Smad3多克隆抗體及辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔二抗均購自北京中杉生物技術(shù)有限公司。生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(上海康為醫(yī)療科技發(fā)展有限公司)，高速冷凍離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠)，垂直電泳儀(美國BioRad公司)。

1.2模型建立及動(dòng)物分組 大鼠隨機(jī)均分為正常對照組，模型組，陽性對照組(卡托普利組)、高、低劑量參附組。模型組按照文獻(xiàn)方法〔6〕腹腔注射多柔比星4 mg/kg，每周1次，共6 w，累計(jì)劑量達(dá)24 mg/kg；正常對照組腹腔注射等劑量0.9%氯化鈉溶液；卡托普利100 mg·kg-1·d-1于實(shí)驗(yàn)開始前1 w灌胃。參附組于造模后1 w，腹腔注射參附注射液1 ml/kg，4 ml/kg，1次/d，共2 w。試驗(yàn)結(jié)束后，模型組有2只大鼠死亡，低劑量參附組1只死亡，其余大鼠納入試驗(yàn)結(jié)果中。

1.3心功能測定 參附注射液末次給藥后24 h后，腹腔麻醉大鼠，經(jīng)右頸總動(dòng)脈插管至左心室，生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)檢測心功能，測定左室收縮末壓(LVESP)、左室舒張末壓(LVEDP)及左心室內(nèi)壓最大上升/下降速率(±dp/dtmax)。

1.4心肌組織Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)檢測 取心肌組織勻漿，按照ELISA 試劑盒說明書檢測。

1.5心肌細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 10%甲醛固定部分心室，乙醇脫水后石蠟包埋，5 μg切片，蘇木素-伊紅(HE)染色后于光學(xué)顯微鏡下觀察。

1.6Western印跡法檢測心肌細(xì)胞TGF-β1、Smad3 蛋白表達(dá) 取待測心肌，裂解提取蛋白，聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)法測定蛋白質(zhì)含量。上樣電泳轉(zhuǎn)膜，三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液(TBS)沖洗，封閉，加入TGF-β1、Smad3多克隆抗體(1∶1 000稀釋)4℃過夜孵育，Tween-20 Tris鹽酸緩沖液(TBST)洗膜3次，加入羊抗兔二抗(1∶500稀釋)，室溫孵育1 h，TBST洗膜3次。顯色液中避光顯色。蛋白質(zhì)印跡顯影圖掃描，凝膠自動(dòng)分析成像軟件進(jìn)行灰度值(A)分析。用目標(biāo)蛋白表達(dá)量的灰度值與內(nèi)參蛋白(β-actin)的灰度值比值表示目標(biāo)蛋白的相對表達(dá)量。

1.7數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì) 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD法t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1各組心功能測定 與正常對照組相比，模型組 LVESP和±dP/dtmax 均明顯下降，LVEDP顯著上升(P<0.01)；與模型組相比，卡托普利組、高、低劑量參附組LVESP和±dP/dtmax 顯著升高(P<0.01)，LVEDP顯著下降(P<0.05)?？ㄍ衅绽M和高劑量參附組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，和低劑量參附組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.2心肌形態(tài)學(xué)變化 正常對照組肌纖維完整，心肌細(xì)胞形態(tài)規(guī)則，間質(zhì)未見血管擴(kuò)張。模型組心肌纖維腫脹、斷裂，炎性細(xì)胞浸潤?？ㄍ衅绽M肌纖維輕度腫脹，血管擴(kuò)張和炎性細(xì)胞浸潤程度減輕。高劑量參附組肌纖維腫脹減輕，炎性細(xì)胞偶有浸潤。見圖1。

2.3心肌組織中Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白表達(dá) 與正常對照組比較，模型組心肌組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng) (P<0.01)；與模型組比較，卡托普利組和高劑量參附組心肌組織中Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)明顯減弱(P<0.01)?？ㄍ衅绽M和高劑量參附組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，和低劑量參附組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

2.4各組心肌細(xì)胞TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá) 與正常對照組比較，模型組心肌細(xì)胞的TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)明顯增強(qiáng) (P<0.01)；與模型組比較，卡托普利組和高劑量參附組心肌細(xì)胞的TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)明顯減弱(P<0.01)?？ㄍ衅绽M和高劑量參附組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，和低劑量參附組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1、圖2。

圖1 各組心肌組織 HE 染色變化(×200)

組別LVESPLVEDP+dp/dtmax-dp/dtmaxⅠ型膠原(mg/L)Ⅲ型膠原(mg/L)TGF?β1/β?actinSmad3/β?actin正常對照組135±13255±123956±563764±751755±1571254±134024±001018±000模型組76±1021)107±221)2854±261)3064±431)3028±1251)2564±0881)078±0431)064±0121)卡托普利組118±932)63±042)3618±252)3496±182)1524±1082)1314±1352)032±0202)030±0042)低劑量參附組95±833)82±183)3134±523)2824±293)2426±1143)2132±1023)052±0323)051±0233)高劑量參附組128±962)4)59±102)4)3789±322)4)3602±282)4)1698±2012)4)1201±0422)4)029±0052)4)023±0102)4)

與正常對照組比較：1)P<0.01；與模型組比較：2)P<0.01，3)P<0.05；與低劑量參附組比較：4)<0.05

1.正常對照組；2.模型組；3.卡托普利組；4.低劑量參附組；5.高劑量參附組圖2 各組心肌細(xì)胞TGF-β1、Smad3蛋白表達(dá)

3 討 論

多柔比星是臨床常見的抗腫瘤藥物，但其劑量相關(guān)的心肌毒性可引起心肌細(xì)胞鈣超載和跨膜電位紊亂〔7〕，還可以導(dǎo)致心肌纖維化產(chǎn)生類似于擴(kuò)張型心肌病的病理改變〔8〕。心肌膠原纖維主要由Ⅰ、Ⅲ 型膠原蛋白組成，Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白的表達(dá)反映出心肌纖維化的嚴(yán)重程度〔9〕。TGF-β1是具有多重生物學(xué)效應(yīng)的生長因子，與心肌纖維化發(fā)生密切相關(guān)〔10，11〕。Smad3蛋白是TGF-β1下游蛋白，把TGF-β1信號從細(xì)胞外傳遞到細(xì)胞核，TGF-β1蛋白表達(dá)上調(diào)常伴隨著Smad3的表達(dá)上調(diào)〔12〕。TGF-β1/Smad3信號通路可抑制細(xì)胞外膠原蛋白分解酶的釋放，抑制膠原蛋白分解，促進(jìn)纖維化形成〔13〕。

參附注射液中的人參皂苷等成分可改善心肌傳導(dǎo)，維持心肌細(xì)胞膜完整性，其Ca2+拮抗作用可改善心臟的收縮和舒張功能〔14〕。本文說明參附注射液能減輕多柔比星致大鼠心功能損害。參附注射液可減輕多柔比星心肌纖維化的損害。本文結(jié)果表明TGF-β1/Smad3 蛋白表達(dá)增加可能促進(jìn)了心肌纖維化的發(fā)展。參附注射液可不同程度抑制心肌病大鼠心肌組織TGF-β1和Smad3蛋白的表達(dá)。

綜上，多柔比對心肌的損害可表現(xiàn)為心肌纖維化，心功能下降。Ⅰ型和Ⅲ型膠原蛋白表達(dá)增多，TGF-β1/Smad3 蛋白表達(dá)增加。而參附注射液可使心肌病大鼠心功能改善，膠原蛋白表達(dá)減少，TGF-β1/Smad3 表達(dá)減少。其可能通過調(diào)節(jié)TGF-β1/Smad3蛋白表達(dá)來抑制心肌纖維化的發(fā)展。

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