黃芩素通過線粒體凋亡途徑誘導體外培養(yǎng)喉癌細胞凋亡的機制

孫吉鳳 何海濤

(長春醫(yī)學高等?？茖W校，吉林 長春 130031)

黃芩素(BAI)是一種從傳統(tǒng)中藥黃芩的根中提取出的黃酮類化合物〔1，2〕，具有多種藥理作用，在臨床上應用廣泛。BAI具有抗乳腺癌、食管癌、胃癌等作用〔3,4〕。喉癌是一種耳鼻咽喉頭頸部最常見的惡性腫瘤，絕大部分為鱗狀細胞癌。近年來，其發(fā)病率正在穩(wěn)步上升〔5,6〕。喉癌的臨床治療手段不斷被改進，但其化療效果仍不理想。近年來從天然中藥資源中發(fā)掘有效抗癌藥物成為腫瘤藥物研發(fā)的熱點。本實驗旨在研究不同濃度BAI通過線粒體凋亡途徑誘導體外培養(yǎng)的人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞凋亡的分子機制。

1 材料及方法

1.1細胞與試劑 人喉癌Hep-2 細胞購于ATCC公司。RPMI1640培養(yǎng)基為Gibco/BRL公司產品。BAI、碘化丙啶(PI)購于Sigma公司，BAI用二甲基亞砜(DMSO)溶解后置于-20℃冰箱保存。半胱天冬酶(caspase)-3、caspase-9活性檢測試劑盒購于Chemicon公司。Bradford法蛋白含量檢測試劑盒購于凱基生物技術公司。Trizol 試劑購于美國Invitrogen 公司，逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)試劑盒購自Takara公司，Bcl-2、Bax、GAPDH 基因引物由IDT公司合成。兔抗人caspase-3、caspase-9、Bcl-2、Bax和GAPDH 單克隆抗體及辣根過氧化物酶(HRP)標記的鼠抗兔免疫球蛋白(Ig)G購自美國Cell Signaling公司，電化學發(fā)光(ECL)檢測試劑盒購自Millipore公司。

1.2細胞培養(yǎng) 喉癌細胞株Hep-2于含5%胎牛血清(FBS)的RPMI1640培養(yǎng)液中，37℃，全濕度，5%CO2孵箱中傳代培養(yǎng)。

1.3檢測細胞凋亡情況 采用流式細胞術(FCM)，取對數期生長的Hep-2細胞以1×106細胞數接種于培養(yǎng)瓶中，常規(guī)培養(yǎng)和同步化培養(yǎng)各24 h后，分別加入BAI(終濃度分別為20、40、80 μmol/L)，設5個平行樣，同時設陰性對照組。分別培養(yǎng)24、48 h后，經4℃、1 000 r/min離心，制成單層細胞懸液，取1 ml濃度為5×105個/ml細胞，4℃的70%乙醇固定24 h，加入含RNaseA的PI染液，37℃避光染色30 min，300目細胞篩過濾，混勻，待測。

1.4檢測對caspase-3、9激活作用 按上述方法進行培養(yǎng)，并加入BAI(終濃度為20、40、80、120 μmol/L)，同時設陰性對照組，設5個平行樣。分別培養(yǎng)24、48 h后，按照說明書(Chemicon公司)操作，消化收集細胞，裂解細胞，提取蛋白并Bradford法定量后，用分光光度法分別檢測各組OD405 nm(發(fā)色基團在此波長處存在最大吸收峰)，由于不同活性的caspase-3及caspase-9對試劑盒提供的底物(序列特異性的多肽與發(fā)色基團耦聯(lián)的復合物)的剪切能力與剪切下來的發(fā)色基團量呈正比，最后計算 OD給藥組/OD陰性對照的倍數來表示 caspase-3、caspase-9活化程度。

1.5檢測Bcl-2和Bax mRNA表達 按上述方法進行細胞培養(yǎng)，并分別加入BAI(終濃度為20、40、80 μmol/L)，設陰性對照，繼續(xù)培養(yǎng)至24 h或48 h，分別用Trizol法提取細胞總RNA，鑒定及定量后，用RT-PCR試劑盒將mRNA逆轉錄為cDNA，進行PCR反應。合成引物終濃度為2 μmol/L，引物序列，Bcl-2上游：5′-GTGGAGGAGCTCTTCAGGGA-3′，下游：5′-AGGCACCCAGGGTGATGCA-A-3′，擴增片段長度304 bp；Bax上游：5′-TCCACCAAGAAGCTGAGCGAG-3′，下游：5′-GTCCAGCCCATGATGGTTCT-3′，擴增片段長度257 bp；以GAPDH為內參，擴增片段長度為260 bp。PCR反應參數，Bcl-2為95℃ 5 min預變性，然后進入94℃ 1 min、63℃ 30 s、72℃ 30 s的循環(huán)，之后延伸72℃ 10 min，共28個循環(huán)；Bax 利用梯度(TD)-PCR，先94℃，5 min預變性，然后進入94℃ 30 s、62℃ 30 s、72℃ 2 min的循環(huán)，循環(huán)40次；最后以上個循環(huán)均進入延伸72℃，10 min。內參GAPDH用上述兩個條件均可。PCR產物電泳后用凝膠電泳呈像分析系統(tǒng)進行拍照并分析。

1.6檢測多種凋亡相關基因、蛋白酶及其酶原的蛋白表達 采用Western印跡法，按上述方法進行細胞培養(yǎng)，加入終濃度為40 μmol/L的BAI，設陰性對照，繼續(xù)培養(yǎng)至24、48 h，按試劑說明書操作，收集細胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次后，裂解細胞提取蛋白，測定蛋白濃度。取含50 μg總蛋白樣本進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，分離膠濃度為12%，濃縮膠濃度為5%，分段電壓分別為80、120 V。電泳后，進行蛋白轉聚偏氟乙烯(PVDF)膜，4℃100V，轉膜1 h；然后室溫搖床封閉1.5 h；充分洗膜后，加稀釋的一抗(Bcl-2、Bax及GAPDH單克隆抗體按1∶200稀釋；caspase-3、caspase-9單克隆抗體按1∶1 000稀釋)4℃孵育過夜；充分洗膜后，加稀釋的二抗(HRP-鼠抗兔IgG按1∶4 000)37℃孵育2 h，充分洗膜；按照ECL檢測試劑盒操作；利用BIO-RAD凝膠成像及分析系統(tǒng)對各蛋白條帶進行分析。

1.7統(tǒng)計學方法 采用SPSS18.0 統(tǒng)計軟件進行單因素方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.1BAI誘導細胞凋亡 隨藥物濃度增加，24 h BAI組細胞凋亡率逐漸增加，48 h BAI組細胞凋亡率逐漸增加，同時相同濃度組間，48 h凋亡率顯著高于24 h，見表1；凋亡峰明顯，見圖1；各BAI組與陰性對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；可誘導細胞凋亡，凋亡率增加具有時間和濃度依賴性。

圖1 BAI組誘導Hep-2細胞凋亡

組別24h凋亡率48h凋亡率陰性對照組346±007360±037BAI組 20μmol/L1406±0161)1589±0221)2) 40μmol/L4169±0041)4434±0041)2) 80μmol/L6505±0041)7229±0041)2)

與陰性對照組比較：1)P<0.05；與24 h比較：2)P<0.05；下表同

2.2BAI激活caspase-3、9活性 隨藥物濃度增加，24 h BAI組caspase-3活性從陰性對照組的1.84倍增加到5.20倍；caspase-9活性從陰性對照組的1.53倍增加到3.74倍。48 h BAI組隨藥物濃度增加，caspase-3活性從陰性對照組的1.78倍增加到5.26倍；caspase-9活性從陰性對照組的1.83倍增加到4.75倍；各BAI組與陰性對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。同時相同濃度組間，48 h caspase活性顯著高于24 h(P<0.05)，見表2。提示BAI可以激活caspase-3、caspase-9活性，并具有時間和濃度依賴性。

表2 BAI對Hep-2細胞caspase-3及caspase-9活性的影響

2.3BAI影響B(tài)cl-2及Bax基因mRNA表達 隨BAI濃度增加，Bcl-2 mRNA表達逐漸減少，明顯低于陰性對照組，48 h明顯低于24 h；Bax mRNA表達隨BAI濃度增加而增加，明顯高于陰性對照組，48 h明顯高于24 h；Bcl-2/Bax比隨BAI濃度增加而降低，見圖2、表3，各BAI組與陰性對照組差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。表明BAI抑制癌基因Bcl-2 mRNA表達，促進抑癌基因Bax mRNA表達，具有時間和濃度依賴性。

2.4BAI影響多種凋亡相關基因、蛋白酶及其酶原的表達 40 μmol/L BAI作用后，與陰性對照組相比，隨作用時間增加，BAI組抑癌基因Bax蛋白表達量增加，癌基因Bcl-2蛋白表達量減少；酶原蛋白(procaspase)-9蛋白表達量減少，與之相反，caspase-9蛋白表達量增加；procaspase-3蛋白表達量減少，caspase-3蛋白表達量增加，各BAI組與陰性對照組差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖3和表4。BAI可以上調Bax、caspase-9、caspase-3蛋白表達水平，下調Bcl-2、procaspase-9、procaspase-3蛋白表達水平，具有時間依賴性。

M：DL-2000Marker；1～4為24 h，分別為陰性對照組，BAI組20、40、80 μmol/L；5～8為48 h，分別為陰性對照組，BAI組20、40、80 μmol/L圖2 BAI對Bcl-2、Bax mRNA表達的影響

圖3 Hep-2 細胞內Bax、Bcl-2、procaspase-9、caspase-9、procaspase-3、caspase-3蛋白表達

組別Bcl?2/GAPDH24h48hBax/GAPDH24h48hBcl?2/Bax24h48h陰性對照組1216±0041331±0030394±0020301±003309442BAI組 20μmol/L0723±0021)0631±0042)0624±0031)0810±0042)159078 40μmol/L0415±0031)0388±0011)2)1142±0041)1650±0031)2)036024 80μmol/L0220±0011)0114±0021)2)1300±0021)1917±0011)2)017006

表4 BAI對Bcl-2、Bax、procaspase-9、caspase-9、procaspase-3、caspase-3、蛋白相對表達的影響

3 討 論

黃芩是一味歷史悠久的中藥材，醫(yī)書對黃芩的記載始于《神農本草經》，BAI制劑在臨床中應用于傳染性肝炎、咽炎、急慢性胃腸炎、上呼吸道感染等多種疾病的治療。BAI具有抗乳腺癌、食管癌、胃癌〔3,4〕等作用。本研究團隊進行了一系列有關BAI對人喉癌hep-2細胞作用的研究〔7,8〕。細胞增殖和細胞凋亡都是生命的基本現象，保證機體的正常發(fā)育和健康。已有大量研究表明，腫瘤的發(fā)生是細胞增殖與細胞凋亡失衡所致，近年來通過誘導腫瘤細胞凋亡成為抗腫瘤的一個重要研究方向〔9,10〕。本文結果與前期研究〔7〕吖啶橙染色(AO)法檢測到細胞在BAI(40、80 μmol/L)作用24 h后呈現典型的凋亡形態(tài)結果一致。

促凋亡基因活性受抑制和抗凋亡基因被激活是誘發(fā)腫瘤細胞凋亡而長期存活的主要原因，細胞凋亡是受基因調控的精確過程〔9〕。真核細胞凋亡途徑主要包括死亡受體(外源性)途徑、線粒體(內源性)途徑、B粒酶途徑及內質網途。細胞凋亡主要包括凋亡誘導、調控執(zhí)行和效應3個階段〔11〕。其中線粒體途徑是介導細胞凋亡的主要途徑〔12〕，Bcl-2、Bax家族和caspase在線粒體途徑中發(fā)揮極為重要的作用〔13〕。Bcl-2家族分為Bcl-2亞家族(抗凋亡)、Bax亞家族(促凋亡)及BH3亞家族(促凋亡)三類20余種，其中Bcl-2和Bax是其中最重要的抗凋亡基因(癌基因)和促凋亡基因(抑癌基因)〔14〕。Bax存在于胞質中，在凋亡信號的誘導下，Bax轉移到線粒體外膜處，先形成Bax/Bax二聚體，然后結合成簇〔15〕；與線粒體相互作用，降低線粒體跨膜電位，在Ca2+濃度升高的情況，改變線粒體通透性〔16,17〕。本實驗結果提示BAI可以通過誘導Hep-2細胞Bax mRNA表達上調，進而上調Bax蛋白表達，線粒體外膜處聚集成簇，降低線粒體跨膜電位；BAI具有調控胞質Ca2+濃度升高的能力〔18〕，所以BAI接下來可以改變線粒體通透性。在線粒體凋亡途徑中，線粒體通透性改變后，細胞色素(Cyt)C將從線粒體釋放到胞質。而Bcl-2作為線粒體上的一種跨膜因子，將阻止Bax的這個過程，阻止CytC釋放到胞質。本實驗結果說明BAI可以通過下調Bcl-2表達和上調Bax，促進線粒體凋亡途徑中CytC釋放到胞質。在線粒體凋亡途徑中，從線粒體釋放到胞質的CytC進而與Apaf-1形成多聚體，并進一步與在胞質中以酶原形式存在的caspase-9前體形成凋亡小體，進而激活caspase-9。caspase是一類可引起細胞凋亡的關鍵蛋白酶，其中caspase-9是啟動酶中最重要的一種，caspase-3是效應酶中最重要的一種〔19〕。本實驗結果提示，BAI可以通過線粒體凋亡途徑，進一步激活喉癌細胞的caspase-9。在線粒體凋亡途徑中，激活的caspase-9作為啟動酶，將進一步誘使procaspase-3激活為caspase-3；caspase-3作為最重要的效應酶，將進一步激活激活級聯(lián)反應，將切斷肽鍵、直接破壞細胞結構、降解細胞質、細胞核、細胞骨架、使染色質凝聚、DNA斷裂為DNA梯度等，最終使得細胞凋亡〔17〕。BAI可以誘導Hep-2細胞出現DNA梯度〔8〕。說明BAI可以通過線粒體凋亡途徑進一步激活caspase-3，并發(fā)揮其效應酶作用和后續(xù)級聯(lián)反應，最終誘導細胞凋亡。此外，Bcl-2還有另一方面的作用，可以作為caspase-3的直接底物，抑制caspase-3的合成，抑制凋亡〔19〕。本實驗結果表明，BAI促進caspase-3的合成，促進細胞凋亡。

綜上，BAI通過上調Bax在mRNA和蛋白水平的表達，下調Bcl-2在mRNA和蛋白水平的表達及Bcl-2/Bax，促進Bax在線粒體外膜處聚集成簇，降低線粒體跨膜電位，進而降低線粒體跨膜電位，促進CytC釋放到胞質，進而與激活的caspase-9及Apaf-1形成凋亡小體，進而激活caspase-3及后續(xù)線粒體凋亡途徑，誘導喉癌Hep-2細胞凋亡。

1Li-Weber M.New therapeutic aspects of flavones：the anticancer properties of scutellaria and its main active constituents wogonin，baicalein and baicalin〔J〕.Cancer Treatment Rev，2009；35(1)：57-68.

2辛文妤，宋俊科，何國榮，等.黃芩素和黃芩苷的藥理作用及機制研究進展〔J〕.中國新藥雜志，2013；22(6)：647-53.

3張淑群，高曉燕，薛興歡，等.黃芩素對人乳腺癌MDA-MB-231細胞株SATB1表達的影響〔J〕.中國腫瘤臨床，2014；41(6)：355-8.

4張 偉，劉寬浩.黃芩素對胃癌細胞VEGF和HGF表達的影響〔J〕.現代預防醫(yī)學，2011；38(11)：2135-7.

5陶振峰，申宇鵬.早期喉癌微創(chuàng)治療研究進展〔J〕.解放軍醫(yī)藥雜志，2017；29(11)：114-6.

6中華耳鼻咽喉頭頸外科雜志編輯委員會頭頸外科組.喉癌外科手術及綜合治療專家共識〔J〕.中華耳鼻喉頭頸外科雜志，2014；49(8)：620-6.

7孫吉鳳，劉劍凱，張淑芳.黃芩素對喉癌Hep-2細胞增殖的抑制作用〔J〕.中國醫(yī)學創(chuàng)新，2015；12(21)：4-6.

8孫吉鳳，劉劍凱.黃芩素對喉癌細胞周期、凋亡率及凋亡細胞DNA的影響〔J〕.中國醫(yī)學創(chuàng)新，2018；37(6)：14-6.

9李 娜，高俊巖，劉 敏.細胞凋亡和腫瘤的關系研究進展〔J〕.當代醫(yī)學，2009；15(16)：13-4.

10歐陽高亮，李祺福，洪水根.細胞凋亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展和治療〔J〕.國外醫(yī)學·腫瘤學分冊，2000；27(5)：266-8.

11李 敏，林 俊.細胞凋亡途徑及其機制〔J〕.國際婦產科學雜志，2014；41(2)：103-7.

12閻 海.細胞凋亡研究進展〔J〕.中山大學研究生學刊(自然科學、醫(yī)學版)，2012；33(3)：8-13.

13岳原亦，張 揚，張一奇.Caspase家族與細胞凋亡〔J〕.中國醫(yī)療前沿，2011；6(6)：25-6.

14董雅潔，高維娟.Bcl-2、bax、caspase-3在細胞凋亡中的作用及其關系〔J〕.中國老年學雜志，2012；32(21)：4828-30.

15劉 志，鄭 軍.Bcl-2家族蛋白及其在細胞凋亡中的作用〔J〕.生命的化學，2007；27(1)：22-5.

16王 彤，劉存志，劉玉珍，等.bcl-2 /bax 基因調控機體細胞凋亡的機制研究進展〔J〕.中國老年學雜志，2008；28(16)：1658-60.

17Odonkor CA，Achilefu S.Modulation of effector caspase cleavage determines response of breast and lung tumor cell lines to chemotherapy〔J〕.Cancer Invest，2009；27(4)：417-29.

18Kim SJ，Kim HJ，Kim HR，etal.Antitumor actions of baicalein and wogonin in HT-29 human colorectal cancer cells〔J〕.Mol Med Rep，2012；6(6)：1443-9.

19Ricci JE，Munoz-Pinedo C，Fitzgerald P，etal.Disruption of mitochondrial function during apoptosis is mediated by caspase cleavage of the p75 subunit of complex I of the electron transport chain〔J〕.Cell，2004；117(6)：773-86.