固本舒喘顆粒對(duì)哮喘豚鼠的免疫調(diào)節(jié)作用

俞 琦 馮 果 田維毅

(貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

固本舒喘湯原方由黃芪、何首烏、地龍、苦參、防風(fēng)等十味中藥組成，對(duì)支氣管哮喘防治效果顯著〔1〕。前期研究〔2〕在固定處方的基礎(chǔ)上，將湯劑制成固本舒喘顆粒，并建立了穩(wěn)定、可控的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。目前普遍認(rèn)為哮喘的發(fā)病機(jī)制與免疫失衡有密切關(guān)系，本研究探討固本舒喘顆粒治療哮喘的部分免疫機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)健康豚鼠50只，雌雄各半，體重180～200 g，購(gòu)自貴州醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號(hào)：SCXK(黔)20020001。動(dòng)物隨機(jī)分為正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、固本舒喘顆粒大、小劑量組、潑尼松組各10只。

1.2藥物和主要試劑 自制固本舒喘顆粒，批號(hào)：20081102。卵白蛋白(廈門市健眾生物制品工程有限公司)，Diff快速染色液(上海鈺博生物科技有限公司，批號(hào)：YB40748ES60)，醋酸潑尼松片(上海信誼藥廠有限公司，批號(hào)：100502)，豚鼠免疫球蛋白(Ig)E試劑盒(上海酶聯(lián)生物科技有限公司)，白細(xì)胞介素(IL)-4、IL-5、干擾素(IFN)-γ試劑盒(北京雅安達(dá)生物技術(shù)有限公司)。

1.3儀器 電子分析天平(梅特勒上海公司)，高速低溫離心機(jī)5804D(德國(guó)Eppendorf公司)，超聲霧化器(上海天源醫(yī)用生物有限公司)，ELX800全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTek公司)。

1.4制備哮喘模型 參照文獻(xiàn)方法〔3〕造模。正常對(duì)照組除外，其余4 組每只豚鼠分別用10%卵白蛋白腹腔注射，1 ml/只。首次致敏15 d后，將致敏豚鼠置于4 L密閉玻璃罩中，按400 mmHg恒壓噴入5%卵白蛋白溶液0.5 min，激發(fā)至豚鼠出現(xiàn)煩躁、打噴嚏、呼吸急促、腹肌強(qiáng)烈收縮及伏地現(xiàn)象，為造模成功標(biāo)準(zhǔn)。1次/d，共激發(fā)7 d。

1.5給藥 于霧化當(dāng)天開(kāi)始灌胃給藥，根據(jù)制劑研究結(jié)果確定的用藥劑量，用生理鹽水稀釋藥物，固本舒喘顆粒大、小劑量組分別以10、5 g/kg，潑尼松組以0.001 g/kg灌胃給藥，灌胃體積為0.5 ml/100 g體重，正常對(duì)照組代以等體積生理鹽水，每天1 次，連續(xù)7 d。參照文獻(xiàn)〔4〕，觀察豚鼠發(fā)生呼吸困難、咳嗽的情況，判斷豚鼠反應(yīng)級(jí)數(shù)。分級(jí)方法：1級(jí)，僅見(jiàn)呼吸困難；2級(jí)，可見(jiàn)呼吸困難和咳嗽；3級(jí)，呼吸困難、咳嗽、甚至休克跌倒。

1.6血清IgE、IL-4、IL-5和IFN-γ的測(cè)定 末次霧化24 h后，股動(dòng)脈取血，3 500 r/min離心10 min，分離血清，酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測(cè)血清IgE、IL-4、IL-5和IFN-γ水平，具體操作按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

1.7細(xì)胞計(jì)數(shù) 豚鼠末次霧化24 h后，開(kāi)胸結(jié)扎右主支氣管，用37℃無(wú)菌生理鹽水5 ml推入右主支氣管進(jìn)行灌洗，反復(fù)抽吸3次，回收灌洗液。肺泡灌洗液(BALF)經(jīng)4℃，2 000 r/min離心10 min，用冷磷酸鹽緩沖液(PBS)重懸沉淀細(xì)胞，取5 μl進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；取10 μl常規(guī)涂片，進(jìn)行Diff-Quick快速染色，顯微鏡下分類計(jì)數(shù)細(xì)胞(至少連續(xù)計(jì)數(shù)300個(gè)細(xì)胞)。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS18.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)，方差分析。

2 結(jié) 果

2.1各組氣道反應(yīng)級(jí)數(shù)比較 激發(fā)后，模型對(duì)照組氣道反應(yīng)性顯著增高，出現(xiàn)躁動(dòng)，呼吸急促，抽搐等表現(xiàn)，休克死亡1只。與模型對(duì)照組(2.43±0.33)比較，潑尼松組、固本舒喘顆粒大、小劑量組反應(yīng)級(jí)數(shù)均明顯降低(1.40±0.13、1.60±0.29、2.10±0.25；P<0.05，P<0.01)。

2.2各組血清IgE水平比較 與正常對(duì)照組〔(25.96±2.37)μg/ml〕比較，模型對(duì)照組血清IgE水平顯著升高〔(48.30±3.64)μg/ml,P<0.01〕。與模型對(duì)照組比較，潑尼松組和固本舒喘顆粒大、小劑量組IgE水平明顯下降〔(30.74±2.30)、(32.09±2.72)、(36.80±3.41)μg/ml,P<0.01〕。

2.3各組血清細(xì)胞因子比較 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組血清中IL-4、IL-5水平明顯升高，IFN-γ水平顯著降低(P<0.01)。與模型對(duì)照組比較，固本舒喘顆粒各劑量組和潑尼松組均能顯著降低豚鼠血清IL-4水平(P<0.05或P<0.01)，提高IFN-γ水平(P<0.01)；固本舒喘顆粒大劑量組、潑尼松組能明顯降低IL-5水平(P<0.01)，見(jiàn)表1。

表1 各組血清細(xì)胞因子比較

與正常對(duì)照組比較:1)P<0.01；與模型對(duì)照組比較：2)P<0.05，3)P<0.01，下表同

2.4各組BALF炎癥細(xì)胞表達(dá)比較 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組BALF中嗜酸性粒細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及細(xì)胞總數(shù)明顯上升(P<0.01)。與模型對(duì)照組比較，潑尼松組和固本舒喘顆粒大、小劑量組均能顯著降低BALF細(xì)胞總數(shù)和炎癥細(xì)胞的表達(dá)(P<0.05，P<0.01)。見(jiàn)表2。

表2 固本舒喘顆粒對(duì)哮喘模型豚鼠BALF炎癥細(xì)胞表達(dá)的影響

3 討 論

哮喘的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，哮喘的發(fā)病與諸多炎癥細(xì)胞、生物介質(zhì)等多種免疫因素有關(guān)〔5〕，機(jī)體免疫異常在哮喘的發(fā)病中占據(jù)核心地位〔6〕。研究發(fā)現(xiàn)，嗜酸性粒細(xì)胞在氣道內(nèi)聚集和激活能直接促發(fā)氣道炎癥反應(yīng)，其數(shù)量與病情的嚴(yán)重程度呈正相關(guān)〔7〕；中性粒細(xì)胞可分泌氧代謝類、酶類和花生四烯酸等代謝產(chǎn)物，誘導(dǎo)多種細(xì)胞因子合成與釋放〔8〕；淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞也是引發(fā)哮喘氣道炎癥的關(guān)鍵角色。輔助性T細(xì)胞(Th)1/Th2免疫失衡一直被認(rèn)為是哮喘發(fā)病的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，在整個(gè)氣道炎癥過(guò)程乃至氣道重塑發(fā)生過(guò)程中，都起著極其重要的作用〔9，10〕。Th2型細(xì)胞主要分泌IL-4，IL-5等細(xì)胞因子，可正向調(diào)節(jié)IgE生成與活性，刺激嗜酸粒細(xì)胞增殖、活化，并同時(shí)引起組胺、白三烯等多種炎性介質(zhì)釋放〔11，12〕；IFN-γ由Th1細(xì)胞分泌，主要參與細(xì)胞分化的調(diào)節(jié)，能抑制Th2型細(xì)胞的活性，從而對(duì)氣道炎癥產(chǎn)生有效的抑制作用〔11〕。除以上免疫因素外，氣道反應(yīng)性和血清IgE水平也是反映哮喘炎癥反應(yīng)的重要指標(biāo)〔13〕。固本舒喘顆粒原方具有益氣和衛(wèi)、和血祛風(fēng)、納氣平喘之功效，主要用于氣虛衛(wèi)弱、衛(wèi)氣不固所致的虛喘之癥。本研究結(jié)果均提示固本舒喘顆粒具有顯著免疫調(diào)節(jié)作用，其治療哮喘的作用機(jī)制可能與其下調(diào)血清IgE、IL-4和IL-5水平，上調(diào)IFN-γ表達(dá)及降低肺泡炎癥細(xì)胞數(shù)量有關(guān)。

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