二陳湯對慢性支氣管炎氣道黏液高分泌的影響

尚立芝 吳 珂 謝文英 趙曉云 郜新蓮 張 淼 梁娟娟 王 祎 亓照耀 徐莉莉

(河南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

隨著大氣污染和老齡化日益加重，慢性支氣管炎的發(fā)病率、復(fù)發(fā)率呈劇增趨勢〔1〕。本課題組經(jīng)臨床觀察和前期動物實驗研究證實，基于二陳湯的愛羅咳喘寧能明顯改善慢性支氣管炎患者和動物模型的咳、痰、喘等癥狀，但二陳湯治療慢性支氣管炎的作用及其機制不明〔2～7〕。本研究采用香煙煙霧加內(nèi)毒素制備慢性支氣管炎大鼠模型，觀察二陳湯原方對大鼠支氣管組織中與氣道黏液分泌有關(guān)的黏蛋白(MUC)5AC、水通道蛋白(AQP)5蛋白表達(dá)的影響，探討二陳湯對慢性支氣管炎氣道黏液分泌的作用及機制。

1 材料與方法

1.1藥物、主要試劑與儀器 二陳湯方藥物組成：姜半夏10 g(批號1309001H)、茯苓16 g(批號1309001H)、陳皮10 g(批號1302001H)、甘草6 g(批號1302001S)等為三九醫(yī)藥生產(chǎn)中藥配方顆粒。脂多糖(L8880，701c034，Solarbio公司)，MUC5AC兔抗大鼠一抗試劑盒(bs-7166R)購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司，AQP5兔抗大鼠一抗試劑盒(BA2205)購自武漢博士德生物工程有限公司。LEICA RM 2265全自動輪轉(zhuǎn)切片機、LEICA EM UC7超薄切片機、HI1210攤片機(德國LEICA公司)，OLYMPUS顯微攝像儀及圖像采集系統(tǒng)(JAPAN 20486，TOKYO)，Motic數(shù)字切片掃描與應(yīng)用系統(tǒng)等。

1.2實驗動物與分組 山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司提供7～8月齡SPF級SD雄性大鼠60只，體重(250±20)g，合格證號SCXK魯20130001。隨機分為6組：正常組、模型組、二陳湯高、中、低劑量組組，急支糖漿組，每組10只。正常組和急支糖漿組無死亡，大鼠一般狀況好，體重增加。模型組死亡2只，存活鼠體重下降。二陳湯高、中、低劑量組各死亡1只，存活大鼠體重稍增。

1.3制備模型 正常組不熏煙，第1和第14日經(jīng)氣管注入生理鹽水200 μl。參照文獻(xiàn)及前期研究〔8，9〕，采用熏香煙煙霧加氣管注內(nèi)毒素脂多糖制備慢支大鼠模型。實驗第1、第14日，注入氣管內(nèi)200 μl內(nèi)毒素脂多糖(1 mg/ml)。第2～13日，第15～28日將大鼠置于箱內(nèi)熏香煙煙霧，香煙8支/次，30 min/次，2次/d。

1.4給藥 依據(jù)肺功能檢測和組織病理結(jié)果判斷模型是否成功，模型制備成功后。參考文獻(xiàn)〔10～12〕，急支糖漿組灌胃太極急支糖漿12 g/kg，二陳湯高、中、低劑量組9.80、4.90、2.45 g/kg，灌胃，稀釋成6 ml，2次/d，3 ml/次。正常組及模型組生理鹽水6 ml/d灌胃，連續(xù)14 d。

1.5標(biāo)本制備 取氣管、支氣管組織，甲醛溶液固定、石蠟包埋，5 μm厚切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察氣管、支氣管組織結(jié)構(gòu)。

1.6MUC5AC和AQP5蛋白的原位表達(dá)及結(jié)果判斷〔13〕免疫組化(IHC，S-P)檢測主要步驟按試劑盒說明書操作進(jìn)行。①切片脫蠟至水；②3%H2O2阻斷內(nèi)源性過氧化物酶；③羊血清封閉；④加第一抗工作液(1∶100)4℃孵育過夜；⑤加生物素化二抗工作液；⑥二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后蘇木素復(fù)染。以磷酸鹽緩沖液(PBS)替代一抗作空白對照，已知陽性切片作為陽性對照。以棕黃色顆粒為陽性表達(dá)，不著色為陰性。用Olympus GX51全自動圖像分析系統(tǒng)，每張切片隨機選取400倍10個視野，分析陽性染色吸光度(A)的平均值。

1.7統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.5軟件進(jìn)行方差分析及Spearman等級相關(guān)分析。

2 結(jié) 果

在正常組、模型組細(xì)支氣管MUCSAC均有表達(dá)，陽性表達(dá)信號為胞質(zhì)、胞膜的呈棕黃色，以胞質(zhì)為主。與正常組比較，模型組MUC5AC蛋白表達(dá)明顯增強；與模型組相比，二陳湯高、中劑量組MUC5AC蛋白表達(dá)均顯著降低(均P<0.01)。在正常組、模型組細(xì)支氣管AQP5有陽性表達(dá)，陽性信號為胞質(zhì)棕黃色顆粒為主，細(xì)胞膜也有陽性；與正常組比較，模型組AQP5蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，二陳湯高、中劑量組AQP5蛋白表達(dá)均顯著增強(均P<0.01)，見表1，圖1，圖2。經(jīng)Spearman等級相關(guān)分析顯示，在正常組AQP5蛋白與MUC5AC蛋白表達(dá)呈顯著負(fù)相關(guān)(rs=-0.650,P<0.05)。在模型組(rs=-0.883,P<0.01)和二陳湯中劑量組(rs=-0.795,P<0.01)AQP5蛋白與MUC5AC蛋白表達(dá)呈非常顯著負(fù)相關(guān)。而在二陳湯高(rs=-0.631,P>0.05)和低劑量組(rs=-0.583,P>0.05)AQP5蛋白與MUC5AC蛋白表達(dá)有負(fù)相關(guān)趨勢，但相關(guān)性不顯著。

表1 各組支氣管組織中MUC5AC和AQP5蛋白的表達(dá)

與模型組比較：1)P<0.01

圖1 各組細(xì)支氣管組織MUC5AC蛋白表達(dá)(DAB，×100)

圖2 各組細(xì)支氣管組織AQP5蛋白表達(dá)(DAB，×100)

3 討 論

慢性支氣管炎與感染、過敏、寒冷、吸煙、空氣污染及患者內(nèi)在因素有關(guān)。上述病因刺激可直接或通過神經(jīng)-內(nèi)分泌引起支氣管黏液腺分泌亢進(jìn)，炎癥反復(fù)刺激使呼吸道黏膜假復(fù)層纖毛柱狀上皮損傷，黏液腺肥大、增生。脫落的黏膜、炎性滲出物與黏液混合形成黏液栓，是慢性支氣管炎臨床咳、痰、喘的病理基礎(chǔ)。慢性支氣管炎最初表現(xiàn)為間歇性咳嗽、咳痰，中醫(yī)診斷為“咳嗽”；繼之肺失宣降，久病肺虛伴喘，中醫(yī)又診斷為“喘證”；慢性支氣管炎反復(fù)遷延可并發(fā)肺動脈高壓、肺源性心臟病，出現(xiàn)以心慌、水腫、口唇發(fā)紺等心衰表征時，屬于中醫(yī)的“肺脹”范疇。二陳湯由半夏、陳皮、茯苓、甘草組成。方中半夏燥濕化痰，主治脾濕痰壅之痰多咳喘氣逆；陳皮燥濕化痰，理氣健脾、和胃止嘔；茯苓健脾滲濕，寧心安神；甘草補脾益氣、潤肺止咳。諸藥合用共奏燥濕和中，理氣化痰之功。

基于假復(fù)層纖毛柱狀上皮-黏液共同構(gòu)成纖毛-黏液排送系統(tǒng)。氣道中吸入的粉塵、病原體可被黏液黏附，靠纖毛自下而上擺動，將黏液以痰的形式咳出體外，故黏液是凈化氣道的重要組成部分。慢性支氣管炎患者表現(xiàn)咳嗽、咳痰，痰量多，而且黏稠，不易咳出。其機制是由于黏液分泌過多，纖毛因負(fù)荷過重而發(fā)生粘連、倒伏、甚至脫落。氣道黏液中95%以上是水，其余為離子、蛋白和糖蛋白等〔14〕，黏液中的水與黏蛋白比例失衡，尤其黏液中的高黏蛋白含量增加，使痰液黏稠形成黏液栓，難以咳出，導(dǎo)致氣流受限。AQP5是主要的水轉(zhuǎn)運通道，黏液下腺AQP5的減少可以導(dǎo)致氣道水分含量的減少和黏蛋白濃度增加〔15〕。本研究顯示，AQP5表達(dá)降低引起的黏液中的水分泌下降。作為衡量氣道上皮黏液分泌指標(biāo)的MUCSAC在慢性支氣管炎模型組表達(dá)增加，導(dǎo)致氣道黏蛋白分泌增加，使痰變得黏稠不易咳出，從而繼發(fā)感染，加重病情。Towne等〔16,17〕研究發(fā)現(xiàn)，用TNF-α干預(yù)培養(yǎng)小鼠肺上皮細(xì)胞后AQP5蛋白表達(dá)下降，腫瘤壞死因子(TNF)-α可以誘導(dǎo)大鼠氣管上皮細(xì)胞MUCSAC蛋白的高表達(dá)。本文提示二陳湯可能通過上調(diào)AQP5表達(dá)的同時，下調(diào)黏蛋白MUCSAC的表達(dá)，影響氣道黏液中水分與黏蛋白的比例，從而發(fā)揮其利痰清肺的作用。

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