下調(diào)Six1基因表達(dá)對胃癌細(xì)胞生物學(xué)特性及B7-H1表達(dá)的影響

王建華 王偉偉 王衛(wèi)國

(阜陽市人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽 阜陽 236000)

胃癌患者發(fā)現(xiàn)時(shí)多數(shù)已處于中晚期，研究對胃癌轉(zhuǎn)移、侵襲影響的機(jī)制對于早期發(fā)現(xiàn)及靶向治療具有重要意義〔1〕。Six1是同源異形盒(Hox)基因家族的成員，在多種生物中均有表達(dá)，且參與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔2〕。有研究顯示，在宮頸癌、肺癌等多種腫瘤中Six1呈高表達(dá)，其高表達(dá)不僅能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生惡性增生，且參與腫瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲過程，但調(diào)控的具體機(jī)制目前尚未完全明確〔3,4〕。有研究顯示，胃癌中Six1表達(dá)明顯增高，其表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、臨床分期等明顯相關(guān)，可能是胃癌預(yù)后評估的一個(gè)獨(dú)立生物標(biāo)志物〔5〕；沉默胃癌中Six1的表達(dá)可降低細(xì)胞的克隆形成數(shù)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及增加對5-氟尿嘧啶化療的敏感性〔6〕。但Six1對胃癌細(xì)胞侵襲及B7-H1表達(dá)的影響尚未清楚。本研究通過RNA干擾技術(shù)沉默胃癌細(xì)胞Six1的表達(dá)，旨在探討Six1對癌細(xì)胞增殖侵襲、B7-H1表達(dá)的影響。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞及主要試劑和儀器 人正常胃黏膜上皮細(xì)胞GES-1及胃癌MKN45、AGS和BGC823細(xì)胞均購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶、MTT試劑均購自美國Gibco；Bradford蛋白定量試劑盒購自北京百泰克生物；Transwell小室購自美國Coming Costar；Six1、B7-H1、p-JAK2、p-STAT3、細(xì)胞周期蛋白(cyclin)D1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-2抗體均購自美國Abcam；酶標(biāo)儀購自美國Bbio-TEK；流式細(xì)胞儀購自美國BD。

1.2細(xì)胞培養(yǎng) GES-1、MKN45和BGC823細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)基，AGS細(xì)胞用F12K培養(yǎng)基，于5%體積分?jǐn)?shù)的CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)，隔天換液，細(xì)胞生長達(dá)85%左右融合時(shí)，胰酶消化后傳代。實(shí)驗(yàn)選擇生長至對數(shù)期的細(xì)胞。

1.3細(xì)胞轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前1 d以1×106/ml接種生長至對數(shù)期的BGC823細(xì)胞(2 ml無抗生素培養(yǎng)液)于6孔板，以便次日轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞生長融合可達(dá)60%～80%。轉(zhuǎn)染參照脂質(zhì)體LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說明進(jìn)行操作，分別轉(zhuǎn)染NC組(非特異性siRNA)和si-Six1(轉(zhuǎn)染Six1特異性的siRNA的干擾組)，并設(shè)置僅加入脂質(zhì)體的為空白對照組，轉(zhuǎn)染后于5%體積分?jǐn)?shù)的CO2培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)6 h，換為含血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.4Western印跡檢測蛋白表達(dá) 胰酶消化離心生長至對數(shù)期的GES-1、MKN45、AGS和BGC823細(xì)胞及按照1.3分組轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，加入細(xì)胞裂解液，反復(fù)吹打以使細(xì)胞能夠充分裂解，裂解完全后離心，收集上清(上清為提取的蛋白)，Bradford法對蛋白進(jìn)行定量，取上清液50 μg與2倍十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液按照4∶1比例充分混勻，100℃煮沸變性，每孔道上樣40 μg變性蛋白，經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)(10%)后，電轉(zhuǎn)移蛋白至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%脫脂奶粉封閉轉(zhuǎn)好的PVDF膜1 h，4℃搖床孵育已稀釋好的Six1、B7-H1、p-JAK2、p-STAT3、cyclinD1、MMP-2和內(nèi)參GAPDH抗體(按照1∶500～1 000稀釋)過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫孵育2 h，ECL化學(xué)發(fā)光顯影。凝膠自動(dòng)分析軟件進(jìn)行分析。以Six1、B7-H1、p-JAK2、p-STAT3、cyclinD1、MMP-2與內(nèi)參GAPDH的吸光度比值作為各蛋白的相對表達(dá)量。

1.5MMT法測定各組細(xì)胞活力 每孔5×103個(gè)細(xì)胞接種生長至對數(shù)期的BGC823細(xì)胞于96孔板，培養(yǎng)箱內(nèi)常規(guī)培養(yǎng)24 h后參照1.3分組轉(zhuǎn)染，于轉(zhuǎn)染的48 h在每孔中加入MTT液(5 mg/ml)20 μl，繼續(xù)培養(yǎng)5 h，除去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl二甲基亞砜(DMSO)，室溫?fù)u床混勻15 min，酶標(biāo)儀測定各孔吸光度值(OD值，490 nm)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6Transwell小室測定各組細(xì)胞侵襲能力 4℃冰箱解凍Matrigel膠，與無血清的DMEM培養(yǎng)液按照1∶8比例混合均勻，每孔加入80 μl鋪在24孔Transwell小室上室，于培養(yǎng)箱內(nèi)37℃培養(yǎng)3 h，收集按照1.3分組轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，胰酶消化后制備成單細(xì)胞懸液，每孔5×103個(gè)接種在上室，放置上室于24孔板中，加入無血清的培養(yǎng)液250 μl在上室中，下室中加入含血清的培養(yǎng)液750 μl，培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h后取出小室，棉簽輕輕擦掉上室底部基質(zhì)膠及未侵襲的細(xì)胞，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌后甲醇固定30 min，結(jié)晶紫染色20 min，室溫風(fēng)干，隨機(jī)選擇5個(gè)視野，顯微鏡下計(jì)數(shù)，求均值。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1胃癌細(xì)胞中Six1的表達(dá) 胃癌MKN45、BGC823和AGS細(xì)胞中Six1的蛋白表達(dá)(0.237±0.026，0.555±0.049，0.387±0.041)均顯著高于在GES-1細(xì)胞中的表達(dá)(0.102±0.011，P<0.05)，見圖1。

圖1 胃癌細(xì)胞中Six1的表達(dá)

2.2si-Six1轉(zhuǎn)染抑制BGC823細(xì)胞活力及侵襲能力 MTT及Transwell小室檢測結(jié)果顯示，與NC組比較，si-Six1組細(xì)胞活力及侵襲能力均顯著降低(P<0.05)，見表1。

表1 si-Six1轉(zhuǎn)染抑制BGC823細(xì)胞活力及侵襲能力

與NC組比較：1)P<0.05；下表同

2.3si-Six1轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞效果 si-Six1轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞48 h，si-Six1組Six1的表達(dá)(0.091±0.010)顯著低于空白對照組(0.342±0.035，P<0.05)，而NC組(0.334±0.032)與空白對照組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2。

圖2 si-Six1轉(zhuǎn)染BGC823細(xì)胞后各組細(xì)胞Six1的蛋白表達(dá)

2.4si-Six1轉(zhuǎn)染降低BGC823細(xì)胞B7-H1蛋白表達(dá) Western印跡檢測顯示，與NC組(0.508±0.051)比較，si-Six1組B7-H1蛋白表達(dá)(0.108±0.011)顯著降低(P<0.05)，空白對照組(0.529±0.056)與NC組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖3。

圖3 si-Six1轉(zhuǎn)染對BGC823細(xì)胞B7-H1蛋白表達(dá)的影響

2.5si-Six1轉(zhuǎn)染下調(diào)BGC823細(xì)胞JAK2/STAT3信號 Western印跡檢測結(jié)果顯示，與NC組比較，si-Six1組p-JAK2、p-STAT3、cyclinD1和MMP-2的蛋白表達(dá)均顯著降低(均P<0.05)，見圖4，表2。

圖4 si-Six1轉(zhuǎn)染對BGC823細(xì)胞p-JAK2、p-STAT3、cyclinD1、MMP-2蛋白表達(dá)的影響

組別p?JAK2p?STAT3cyclinD1MMP?2空白對照組0111±00100173±00200452±00480257±0026NC組0121±00130157±00180471±00500280±0028si?Six1組0047±00071)0038±00061)0146±00181)0141±00151)

3 討 論

Hox是在進(jìn)化高度保守的一類DNA序列，Six1是新近發(fā)現(xiàn)的Hox家族成員，Six1在Six家族中研究最多，有研究顯示，Six1蛋白是多種器官發(fā)育所必需的，可維持細(xì)胞生存，細(xì)胞周期及抑制細(xì)胞凋亡〔7,8〕。多種腫瘤中Six1出現(xiàn)過表達(dá)，可促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化，活化細(xì)胞周期，但其作用機(jī)制尚未清楚。但也有研究指出，抑制腫瘤中Six1的表達(dá)可降低其發(fā)生發(fā)展〔9〕。如宮頸癌中上調(diào)Six1表達(dá)可加快癌細(xì)胞增殖，增加細(xì)胞侵襲能力，縮短細(xì)胞周期，而下調(diào)Six1表達(dá)后細(xì)胞增殖及侵襲能力均顯著降低，且阻滯細(xì)胞在G2/M期〔10〕；肺癌中下調(diào)Six1表達(dá)后癌細(xì)胞的增殖及遷移能力均明顯降低〔11〕。

RNA干擾是沉默基因表達(dá)的一種方法，由于其可有效抑制分裂期和非分裂期細(xì)胞，且具有特異性、高效性等優(yōu)勢，已廣泛應(yīng)用于基因治療和基因功能研究等方面〔12，13〕。本研究結(jié)果顯示，RNA干擾Six1后BGC823細(xì)胞中Six1的表達(dá)明顯降低，且可有效降低細(xì)胞的活力及侵襲能力，提示抑制Six1表達(dá)可降低胃癌的發(fā)生發(fā)展。B7-H1是B7家族中的一員，是一種重要的負(fù)性協(xié)同刺激分子，可介導(dǎo)腫瘤發(fā)生免疫逃逸〔14〕。有研究顯示，胃癌中B7-H1的表達(dá)升高，與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤浸潤深度等有關(guān)，可能是判斷胃癌預(yù)后的一個(gè)新指標(biāo)〔15〕。在卵巢癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞非接觸共培養(yǎng)后，可發(fā)現(xiàn)兩種細(xì)胞B7-H1表達(dá)均比非培養(yǎng)組有明顯增高，而抑制JAK2/STAT3等信號通路后B7-H1的表達(dá)受到抑制〔16〕。這提示抑制JAK2/STAT3信號可能影響B(tài)7-H1的表達(dá)。JAK2/STAT3的活化與胃癌、乳腺癌等多種腫瘤的惡化有關(guān)〔17.18〕，有研究顯示，阻斷肝癌JAK2/STAT3信號可降低癌細(xì)胞增殖，且下調(diào)下游分子survivin〔19〕，抑制胃癌中JAK2/STAT3信號可降低腫瘤細(xì)胞侵襲能力，且下調(diào)下游分子MMP-2和MMP-9的表達(dá)〔20〕。本研究結(jié)果提示Six1可通過下調(diào)JAK2/STAT3信號影響胃癌的增殖、侵襲及免疫。

綜上，下調(diào)胃癌細(xì)胞Six1表達(dá)可降低癌細(xì)胞活力及侵襲能力，降低B7-H1表達(dá)，機(jī)制可能是抑制JAK2/STAT3信號通路。Six1可能是胃癌分子診療的一個(gè)新的靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步深入的研究。

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