RNA干涉5-脂氧合酶基因表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長抑制及ROS含量、NF-κB通路的影響

金 強(qiáng) 姚曉玲 胡恩赑

(蚌埠市第三人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽 蚌埠 233000)

結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展是包含錯(cuò)配修復(fù)基因突變、抑癌基因缺失或失活及癌基因激活等多階段、多基因的一個(gè)復(fù)雜過程，闡明結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制具有重要意義〔1〕。目前，多項(xiàng)研究顯示腫瘤與脂質(zhì)體代謝紊亂存在相關(guān)性，5-脂氧合酶(LOX)是花生四烯酸代謝的一個(gè)關(guān)鍵酶，在正常組織中低表達(dá)或不表達(dá)，而在前列腺癌、肺癌、胰腺癌等多種腫瘤中過度表達(dá)，其過度表達(dá)可加速腫瘤細(xì)胞增殖、抑制腫瘤細(xì)胞分化和凋亡，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)〔2～4〕。有研究顯示，結(jié)直腸癌中5-LOX表達(dá)上調(diào)，且表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、浸潤深度和TNM分期有關(guān)〔5〕，5-LOX抑制劑可抑制癌細(xì)胞生長。RNA干擾是一種能使轉(zhuǎn)錄后的基因發(fā)生沉默的方法，具有高度的有效性、特異性，已成為研究基因功能有效的工具〔6〕。因此，本研究旨在觀察抑制5-LOX表達(dá)后對(duì)人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞活力、凋亡的影響及可能分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1主要試劑和儀器 RPMI1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco；脂質(zhì)體LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen；DCFH-DA熒光試劑購自美國Sigma；Bradford試劑盒、電化學(xué)發(fā)光法(ECL)發(fā)光試劑盒均購自碧云天生物；酶標(biāo)儀及Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒均購自美國Thermo；CCK8試劑購自日本Tonjindo公司；5-LOX、p-IκBα、cyclinD1、Bcl-2抗體均購自美國Abcam；流式細(xì)胞儀購自美國Biorad。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 人結(jié)直腸癌HCT116細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫；HCT116細(xì)胞復(fù)蘇后用RPMI1640培養(yǎng)基(含有10%小牛血清)常規(guī)培養(yǎng)和傳代。實(shí)驗(yàn)選擇生長至對(duì)數(shù)期的細(xì)胞。參照LipofectamineTM2000產(chǎn)品說明書進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染前1 d以每孔2.5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板，每孔1 ml，共設(shè)置三組，分別為對(duì)照組(僅加入脂質(zhì)體)、陰性對(duì)照組(NC組，無意義的siRNA系列)和si-5-LOX組(5-LOX的特異性siRNA干擾序列)，均委托廣州銳博生物設(shè)計(jì)并合成，細(xì)胞達(dá)60%～75%生長融合時(shí)，換為不含血清和抗生素的培養(yǎng)液，參照轉(zhuǎn)染說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)5～6 h，換為含血清和無抗生素培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

1.3蛋白質(zhì)印跡 適量的RIPA裂解液提取轉(zhuǎn)染si-5-LOX后48 h的各組HCT116細(xì)胞的總蛋白，Bradford試劑盒對(duì)蛋白濃度進(jìn)行檢測，蛋白樣品與適量上樣緩沖液混勻后100℃變性5 min，每孔中上樣40 μg變性蛋白行十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電冰(SDS-PAGE)，蛋白分離后通過電轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，5%的脫脂奶粉于室溫條件下封閉轉(zhuǎn)好的PVDF膜1 h，洗膜，4℃搖床孵育5-LOX、p-IκBα、cyclinD1、Bcl-2和內(nèi)參GAPDH抗體(皆按照1∶1 000稀釋)過夜，洗膜，加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗，室溫條件孵育1 h，洗膜，ECL發(fā)光劑顯影，自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)采集圖像。

1.4CCK8檢測細(xì)胞活力 以每孔100 μl(約4×103個(gè)細(xì)胞)接種生長至對(duì)數(shù)期的HCT116細(xì)胞于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后參照1.2方法轉(zhuǎn)染，每組設(shè)置5個(gè)平行孔，于轉(zhuǎn)染的24、48和72 h通過CCK8法檢測細(xì)胞活力，檢測前在每孔中加入CCK8試劑10 μl，培養(yǎng)箱孵育1 h，酶標(biāo)儀測定450 nm吸光度值(OD值)，以O(shè)D值反映細(xì)胞活力，可以間接反映出細(xì)胞的增殖能力。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡 采用Annexin V-FITC/PI雙染法進(jìn)行熒光染色。預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌轉(zhuǎn)染48 h的三組細(xì)胞，胰酶消化后重懸細(xì)胞于500 μl的Binding緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測凋亡情況。具體操作參照細(xì)胞凋亡試劑盒。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6流式細(xì)胞儀檢測活性氧(ROS)含量 PBS洗滌轉(zhuǎn)染48 h的細(xì)胞，將細(xì)胞懸浮于含有DCFH-DA(終濃度為10 μmol/L)的無血清培養(yǎng)液中，避光、37℃培養(yǎng)箱孵育20 min，每間隔3～5 min顛倒一下，以保證細(xì)胞和探針能夠接觸充分，孵育完畢，使用培養(yǎng)基(不含血清)洗滌細(xì)胞3次，以除去沒有進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA，通過流式細(xì)胞儀在488 nm的激發(fā)波長和525 nm的最大發(fā)射波長檢測。由于檢測的熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)的ROS水平表現(xiàn)出正相關(guān)，因此可用熒光強(qiáng)度大小反映細(xì)胞內(nèi)的ROS水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS21.0軟件，計(jì)量資料多組差異比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1轉(zhuǎn)染5-LOX siRNA的HCT116細(xì)胞中5-LOX的表達(dá) NC組5-LOX的蛋白表達(dá)(0.324±0.036)與對(duì)照組(0.311±0.034)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而si-5-LOX組5-LOX的蛋白表達(dá)(0.131±0.015)顯著低于對(duì)照組(P<0.05)。見圖1。

圖1 轉(zhuǎn)染5-LOX siRNA的HCT116細(xì)胞中5-LOX的表達(dá)

2.2沉默5-LOX的表達(dá)降低HCT116細(xì)胞活力 與NC組比較，si-5-LOX組在24、48、72 h的細(xì)胞活力均顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 沉默5-LOX的表達(dá)對(duì)HCT116細(xì)胞活力的影響值，n=3)

與NC組比較：1)P<0.05；下表同

2.3沉默5-LOX表達(dá)誘導(dǎo)HCT116細(xì)胞凋亡 與NC組〔(2.36±0.45)%〕比較，si-5-LOX組細(xì)胞凋亡率〔(15.18±1.11)%〕顯著升高(P<0.05)，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率〔(2.24±0.41)%〕與NC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.4沉默5-LOX的表達(dá)降低HCT116細(xì)胞ROS含量 與NC組(17.3±1.6)比較，si-5-LOX組的ROS含量(32.7±3.2)顯著升高(P<0.05),對(duì)照組ROS含量(16.6±1.1)與NC組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.5沉默5-LOX的表達(dá)下調(diào)NF-κB信號(hào)通路 與NC組比較，si-5-LOX組p-IκBα的蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)，cyclinD1和Bcl-2的蛋白表達(dá)均顯著降低(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 沉默5-LOX表達(dá)對(duì)NF-κB信號(hào)通路的影響

組別p?IκBαcyclinD1Bcl?2對(duì)照組0093±00130333±00340261±0026NC組0096±00120348±00360254±0024si?5?LOX組0194±00221)0164±00201)0137±00161)

3 討 論

腫瘤細(xì)胞的增殖過快和凋亡減少是降低癌癥患者生存率的一個(gè)主要原因，因此降低腫瘤細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡可有效降低癌癥患者的死亡率。近些年的研究顯示，腫瘤細(xì)胞中5-LOX的促增殖和抑凋亡作用是引起腫瘤發(fā)生發(fā)展的一個(gè)重要環(huán)節(jié)。目前已發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤中5-LOX出現(xiàn)過表達(dá)，其表達(dá)可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展〔7，8〕。有研究顯示，通過RNA干擾技術(shù)抑制胰腺癌5-LOX表達(dá)可降低細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔9〕；抑制肝癌5-LOX表達(dá)可降低肝癌移植瘤的生長〔10〕。本研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞中5-LOX表達(dá)明顯降低，且轉(zhuǎn)染5-LOX的siRNA后的結(jié)直腸癌細(xì)胞活力明顯降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高。有研究發(fā)現(xiàn)5-LOX抑制劑可抑制腦膠質(zhì)瘤等多種腫瘤的增殖和誘導(dǎo)凋亡〔11〕。因此，本研究提示采用RNA干擾技術(shù)抑制5-LOX表達(dá)同樣可能達(dá)到治療結(jié)直腸癌的目的。

有研究證實(shí)，細(xì)胞內(nèi)因氧化應(yīng)激產(chǎn)生的ROS可能會(huì)作用于信號(hào)分子，對(duì)細(xì)胞的增殖、凋亡、分化、自噬等生命活動(dòng)進(jìn)行調(diào)控，細(xì)胞內(nèi)大量的ROS積聚可引起細(xì)胞凋亡〔12，13〕。LOX是人體內(nèi)活性氧產(chǎn)生的一個(gè)來源，其代謝產(chǎn)物既可以通過引起NADPH氧化產(chǎn)生ROS，也可以作為ROS而發(fā)揮直接的效應(yīng)〔14〕。有研究顯示，5-LOX抑制劑可降低細(xì)胞內(nèi)的ROS水平〔15〕。NF-κB是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，參與腫瘤、免疫、炎癥等的發(fā)生發(fā)展；靜息狀態(tài)下，NF-κB可與抑制因子IκBɑ結(jié)合而在細(xì)胞質(zhì)中滯留，當(dāng)細(xì)胞被應(yīng)激狀態(tài)或外界刺激影響時(shí)，會(huì)將相應(yīng)的信號(hào)傳導(dǎo)通路啟動(dòng)，使IKK激活，引起IκBɑ發(fā)生磷酸化，并使其降解，從而將NF-κB釋放入核而行使轉(zhuǎn)錄因子功能，誘導(dǎo)cyclinD1、Bcl-2等靶基因的表達(dá)〔16，17〕。cyclinD1與細(xì)胞增殖有密切相關(guān)，Bcl-2是Bcl-2家族一員，發(fā)揮抑凋亡作用，多項(xiàng)研究顯示結(jié)直腸癌中NF-κB信號(hào)被激活，可引起cyclinD1和Bcl-2表達(dá)升高〔18〕。也有研究發(fā)現(xiàn)，5-LOX抑制劑可通過下調(diào)Bcl-2和cyclinD1等途徑抑制多種腫瘤的生長〔19，20〕。本研究的結(jié)果顯示，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞中5-LOX表達(dá)后，細(xì)胞內(nèi)的ROS含量明顯升高，磷酸化的IκBɑ表達(dá)升高，Bcl-2和cyclinD1表達(dá)降低。提示5-LOX對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖凋亡的影響可能是通過提高細(xì)胞內(nèi)ROS含量及下調(diào)NF-κB信號(hào)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞5-LOX的表達(dá)可降低細(xì)胞活力及誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與降低細(xì)胞內(nèi)ROS含量和下調(diào)NF-κB信號(hào)通路有關(guān)。本研究提示通過RNA干擾技術(shù)抑制結(jié)直腸癌中高表達(dá)的5-LOX可能是其防治的一種方法，但本研究的內(nèi)容有限，因此還需更多的理論進(jìn)行證實(shí)。

1Wiegering A，Matthes N，Mühling B，etal.Reactivating p53 and inducing tumor apoptosis(RITA) enhances the response of RITA-sensitive colorectal cancer cells to chemotherapeutic agents 5-fluorouracil and oxaliplatin〔J〕.Neoplasia，2017；19(4)：301-9.

2Sarveswaran S，Chakraborty D，Chitale D，etal.Inhibition of 5-lipoxygenase selectively triggers disruption of c-Myc signaling in prostate cancer cells〔J〕.J Biol Chem，2015；290(8)：4994-5006.

3Poczobutt JM，Nguyen TT，Hanson D，etal.Deletion of 5-lipoxygenase in the tumor microenvironment promotes lung cancer progression and metastasis through regulating T cell recruitment〔J〕.J Immunol，2016；196(2)：891-901.

4Zhou GX，Ding XL，Wu SB，etal.Inhibition of 5-lipoxygenase triggers apoptosis in pancreatic cancer cells〔J〕.Oncol Rep，2015；33(2)：661-8.

5Che XH，Chen CL，Ye XL，etal.Dual inhibition of COX-2/5-LOX blocks colon cancer proliferation，migration and invasion in vitro〔J〕.Oncol Rep，2016；35(3)：1680-8.

6李天客，陳 中，包 陽，等.RNA 干擾 SBF2 對(duì)人口腔癌細(xì)胞株 SCC15 增殖，凋亡及侵襲的影響〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2016；36(21)：5260-2.

7Kumar R，Singh AK，Kumar M，etal.Serum 5-LOX：a progressive protein marker for breast cancer and new approach for therapeutic target〔J〕.Carcinogenesis，2016；37(9)：912-7.

8Wen Z，Liu H，Li M，etal.Increased metabolites of 5-lipoxygenase from hypoxic ovarian cancer cells promote tumor-associated macrophage infiltration〔J〕.Oncogene，2015；34(10)：1241-52.

9張海峰，周國雄，丁曉凌，等.靶向 5-LOX的siRNA誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞的凋亡〔J〕.世界華人消化雜志，2008；16(19)：2107-11.

10武云峰，俞廣進(jìn)，夏 俊，等.5-LOX siRNA 抑制人肝癌 HepG-2 細(xì)胞裸鼠移植瘤的生長并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡〔J〕.肝膽外科雜志，2016；24(1)：59-63.

11Wang X，Chen Y，Zhang S，etal.Co-expression of COX-2 and 5-LO in primary glioblastoma is associated with poor prognosis〔J〕.J Neurooncol，2015；125(2)：277-85.

12Li X，Wu G，Shang P，etal.Anti-nephrolithic potential of catechin in melamine-related urolithiasis via the inhibition of ROS，apoptosis，phospho-p38，and osteopontin in male Sprague-Dawley rats〔J〕.Free Rad Res，2015；49(10)：1249-58.

13Palit S，Kar S，Sharma G，etal.Hesperetin induces apoptosis in breast carcinoma by triggering accumulation of ROS and activation of ASK1/JNK pathway〔J〕.J Cell Physiol，2015；230(8)：1729-39.

14Chattopadhyay R，Tinnikov A，Dyukova E，etal.12/15-Lipoxygenase-dependent ROS production is required for diet-induced endothelial barrier dysfunction〔J〕.J Lipid Res，2015；56(3)：562-77.

15Ibrahim AS，Elshafey S，Sellak H，etal.A lipidomic screen of hyperglycemia-treated HRECs links 12/15-Lipoxygenase to microvascular dysfunction during diabetic retinopathy via NADPH oxidase〔J〕.J Lipid Res，2015；56(3)：599-611.

16Ruan J，Qi Z，Shen L，etal.Crosstalk between JNK and NF-κB signaling pathways via HSP27 phosphorylation in HepG2 cells〔J〕.Biochem Biophys Res Commun，2015；456(1)：122-8.

17Zhang J，Pan C，Xu T，etal.Interleukin 18 augments growth ability via NF-κB and p38/ATF2 pathways by targeting cyclin B1，cyclin B2，cyclin A2，and Bcl-2 in BRL-3A rat liver cells〔J〕.Gene，2015；563(1)：45-51.

18Claudius AK，Kankipati CS，Kilari RS，etal.Identification of aspirin analogues that repress NF-κB signalling and demonstrate anti-proliferative activity towards colorectal cancer in vitro and in vivo〔J〕.Oncol Rep，2014；32(4)：1670-80.

19Ratheesh M，Svenia JP，Asha S，etal.Anti-inflammatory effect of a novel formulation of coconut inflorescence sap against ox-LDL induced inflammatory responses in human peripheral blood mononuclear cells by modulating TLR-NF-κB signaling pathway〔J〕.Toxicol Mechanisms Methods，2017；27(8)：615-21.

20Li B，Yang Y，Chen L，etal.18ɑ-Glycyrrhetinic acid monoglucuronide as an anti-inflammatory agent through suppression of the NF-κB and MAPK signaling pathway〔J〕.Med Chem Comm，2017；8(7)：1498-504.