EB和CVA患者誘導(dǎo)痰黏蛋白水平分析及其差異機制

林雪芬 陳裕光 溫武金 洪阿體

深圳市寶安第二集團總醫(yī)院內(nèi)二科，廣東深圳 518104

嗜酸粒細胞性支氣管炎（eosinophilic bronchitis，EB）是一種以嗜酸性粒細胞為主的多種炎性細胞浸潤為特征的慢性氣道炎癥疾病[1]，臨床表現(xiàn)以刺激性干咳為主，細胞學(xué)檢查顯示患者痰液嗜酸性粒細胞增高且合并病理性痰液增多。一項前瞻性研究表明[2]，EB占我國慢性咳嗽病因的22%，僅次于咳嗽變異性哮喘（cough variant asthma，CVA）和上氣道咳嗽綜合征。MUC5AC是氣道黏液中最重要的黏痰白，表達于正常氣道上皮的杯狀細胞內(nèi)，具有保護和潤滑上皮，防御外來刺激物及阻止病原菌入侵等作用[3]。研究顯示[4]，EB與CVA均具有相似的嗜酸粒細胞性氣道炎癥，但EB患者病理性痰液增多的比例與黏痰白水平的類型及機制尚不清楚。本研究旨在通過觀察EB和CVA患者誘導(dǎo)痰中氣道黏痰白MUC5AC、MAC5B及炎癥因子的表達水平，分析EB缺乏黏液高分泌的機制，現(xiàn)報道如下。

表1 三組患者一般資料比較

表2 三組患者黏蛋白水平與炎癥介質(zhì)比較（±s）

表2 三組患者黏蛋白水平與炎癥介質(zhì)比較（±s）

注：與其他兩組比較，*P＜0.05

組別 n MUC5AC（μg/mL） MUC5B（μg/mL） LTC4（pg/mL） PGE2（pg/mL）EB組 20 16.4±6.9 2.7±0.4 311.8±88.5 424.7±127.2*CVA組 20 25.7±8.6* 1.3±0.7* 701.6±163.4* 152.6±65.4對照組 20 13.7±5.2 2.4±0.4 89.3±15.2 122.4±19.2 F 16.000 40.247 165.798 79.871 P 0.000 0.000 0.000 0.000

1 資料與方法

1.1 一般資料

我院2016年10月～2017年4月門診嗜酸粒細胞性支氣管炎病例20例，符合中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會制定的《咳嗽診斷與治療指南（2015）》的EB診斷標準[5]，男14例，女6例，年齡21～52歲，平均（43.4±3.9）歲?？人宰儺愋韵颊?0例，符合中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘學(xué)組制定的《咳嗽變異性哮喘防治指南（2016年版）》的診斷標準[6]，且處于緩解期的輕、中度患者，男13例，女7例，年齡24～58歲，平均（43.2±4.7）歲。健康對照組，體格檢查正常，血常規(guī)、胸部X片正常、肺功能正常，非吸煙者，無過敏體質(zhì)或慢性呼吸系統(tǒng)疾病。三組患者在性別、年齡等一般資料上比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。見表1。

1.2 方法

（1）EB、CVA及健康體檢者于入組后第一天行肺功能檢測，高滲鹽水霧化誘導(dǎo)痰，而后進行痰細胞分類及上清黏蛋白與炎癥介質(zhì)測定；（2）誘導(dǎo)痰及痰液處理方法：首先給予受試者沙丁胺醇氣霧劑（山東京衛(wèi)制藥有限公司，H37022817，200撳，0.10mg/撳）400μg吸入，10min后清水漱口，擤鼻；而后行3%濃度高滲鹽水霧化吸入20min，漱口，將唾液吐干凈后，囑患者用力深咳，咳出痰液至消毒器皿中，而后繼續(xù)霧化至結(jié)束。痰標本處理：用平口鑷取出痰液中粘稠部分，放入EP管中，加入4倍體積的0.1%DTT，漩渦震蕩1min，充分混勻后，37℃水浴10min，采用200目篩網(wǎng)過濾雜質(zhì)，2500r/min離心10min，取上清液放置于-80℃恒溫箱內(nèi)待檢。制作細胞涂片，HE染色，光鏡下進行400個上皮細胞分類；采用ELISA法測定痰液中MUC5AC、 MUC5B及炎癥介質(zhì)白三烯C4（leukotrienes C4，LTC4）、前列腺素 E2（prostaglandin E2，PGE2），黏蛋白試劑盒購自美國CUSABIO 公司，炎癥介質(zhì)試劑盒購自CVAyman 公司，嚴格按照操作規(guī)范進行；（3）肺功能檢測：嚴格按照中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會肺功能專業(yè)組制定的《肺功能檢查指南》[7]進行肺功能檢測，采用德國 Jaeger Mastercope 肺功能儀進行支氣管激發(fā)試驗，由同一操作技師進行。

1.3 評價指標

黏蛋白MUC5AC、MUC5B；炎癥介質(zhì)LTC4、PGE2；痰細胞分類：細胞總數(shù)（total cell count，TCC）、嗜中性粒細胞比例（neutrophils，Neu）、嗜酸性粒細胞比例（eosinophils，EOS）、淋巴細胞比例（lymphocytes，Lym）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

采用統(tǒng)計學(xué)軟件SPSS19.0版對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，計量資料以（±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間比較采用LSD檢驗；相關(guān)性分析采用Pearson線性分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 三組患者黏蛋白水平與炎癥介質(zhì)比較

CVA組MUC5AC水平明顯高于EB組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；CVA組MUC5B水平明顯低于EB組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；CVA組LTC4水平明顯高于其他兩組，EB組PGE2水平明顯高其他兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

2.2 三組患者誘導(dǎo)痰細胞學(xué)分類比較

CVA組細胞總數(shù)、中性粒細胞百分比、嗜酸粒細胞百分比明顯高于其他兩組，EB組細胞總數(shù)、中性粒細胞百分比、嗜酸粒細胞百分比明顯高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 三組患者誘導(dǎo)痰細胞學(xué)分類比較（±s）

表3 三組患者誘導(dǎo)痰細胞學(xué)分類比較（±s）

注：與其他兩組比較，#P＜0.05，與對照組比較，*P＜0.05

組別 n TCC（106/g） Neu（%） EOS（%） Lym（%）EB組 20 2.7±0.8 27.4±12.8* 14.7±10.9* 1.3±1.1 CVA組 20 3.3±0.9# 37.1±18.7# 48.5±21.1# 1.2±0.7對照組 20 1.7±0.4 13.8±3.3 0.3±0.1 1.7±0.9 F 24.348 15.673 65.121 1.673 P 0.000 0.000 0.000 0.197

2.3 相關(guān)性分析

MUC5AC水平與EOS、LTC4呈正相關(guān)（r=0.771，0.864，P＜0.01）；MUC5B水平與PGE2呈正相關(guān)（r=0.692，P ＜ 0.05）。

3 討論

慢性氣道炎癥中氣道黏液水平升高是一項重要的病例特征[8]。在正常人群中，氣道黏液是重要的防御屏障，能夠抵御外界病原菌入侵和中和過敏原作用[9]。當氣道內(nèi)黏液水平過度升高時，會引發(fā)氣道呈高反應(yīng)狀態(tài)，加重氣道炎癥，影響患者生命健康。氣道黏液主要由氣道杯狀細胞和黏膜下腺體合成的黏蛋白、水和電解質(zhì)組成，黏蛋白的主要組成成分是MUC5AC與MUC5B，研究顯示[10]，在CVA患者中MUC5AC水平明顯增高，且有證據(jù)顯示其與哮喘嚴重程度呈正相關(guān)，但尚無確切報道證實MUC5B與哮喘嚴重程度存在相關(guān)性；另外，EB與CVA均具有相似的嗜酸粒細胞性氣道炎癥，但EB患者病理性痰液增多的比例與黏痰白水平的類型及機制尚不清楚。動物實驗表明[11]，在人工建立小鼠哮喘模型中，小鼠受到抗原激發(fā)后，MUC5B水平可無變化或輕度升高。研究EB與CVA患者中誘導(dǎo)痰黏蛋白水平差異及分析其影響機制對于更加針對性的治療慢性氣道炎癥具有重要意義。

本研究結(jié)果提示，CVA組MUC5AC水平明顯高于EB組和對照組，MUC5B水平明顯低于EB組和對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），進一步證實了MUC5AC在誘導(dǎo)痰黏液高分泌中的作用，但從表2看，EB組MUC5AC高于對照組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），羅煒等[12]調(diào)查問卷發(fā)現(xiàn)，近10%的EB患者存在一定程度的黏液高分泌現(xiàn)象，這在一定程度上解釋了本研究的結(jié)果。三組炎癥因子對比結(jié)果提示，CVA組LTC4水平明顯高于其他兩組，EB組PGE2水平明顯高其他兩組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；相關(guān)性分析也得出MUC5AC水平與 EOS、LTC4呈正相關(guān)（r=0.771，0.864，P＜0.01）；MUC5B水平與PGE2呈正相關(guān)（r=0.692，P＜0.05）；證實嗜酸性粒細胞在氣道炎癥的高黏液分泌中扮演著重要角色，至于炎癥因子與黏蛋白的關(guān)系，國內(nèi)研究表明[13-14]，采用PCR技術(shù)誘導(dǎo)痰細胞因子mMRNA表達，發(fā)現(xiàn)CVA和EB患者誘導(dǎo)痰細胞IL-5、IL-4、IL-10表達無差異，但EB組誘導(dǎo)痰中前列腺素E2（PGE2）水平顯著高于CVA組，與本研究結(jié)果一致；另外王嬌莉等[15]在研究EB與CVA患者氣道炎癥細胞與炎癥介質(zhì)的特征中發(fā)現(xiàn)EB組患者誘導(dǎo)痰中PGE 2水平明顯高于CVA組，另外，EB 患者誘導(dǎo)痰中LTC 4 水平無明顯增高，其認為這可以部分解釋EB患者無氣道高反應(yīng)的原因。

綜上所述，EB和CVA患者誘導(dǎo)痰黏蛋白水平存在明顯差異，而炎癥因子比例失衡與嗜酸粒細胞比例不同可能是引起EB缺乏黏液高分泌的機制。但本研究樣本量有限，對于嗜酸性細胞在調(diào)節(jié)黏蛋白水平的機制方面有待進一步研究。

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