河北省區(qū)域試驗大豆品系指紋圖譜構(gòu)建遺傳相似性分析及純度鑒定

徐冬雪，史曉蕾，閆 龍，劉兵強，邸 銳，陳 強，張孟臣，劉志芳，楊春燕*

（1.河北省農(nóng)林科學(xué)院糧油作物研究所，河北省作物遺傳育種實驗室，國家大豆中心石家莊分中心，農(nóng)業(yè)部黃淮海大豆生物學(xué)與遺傳育種重點實驗室，河北 石家莊 050035；2.河北省種子管理總站，河北 石家莊 050031）

大豆是我國重要的糧食和油料作物，也是植物蛋白質(zhì)的主要來源。隨著生活水平的提高和外貿(mào)事業(yè)的發(fā)展，人們對大豆的產(chǎn)量和品質(zhì)要求越來越高。目前我國的大豆來源主要依賴于國外，進(jìn)口大豆數(shù)量居高不下。為扭轉(zhuǎn)這一局面，我們應(yīng)加快大豆新品種的研究與推廣。育種是實現(xiàn)大豆高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效的重要途徑之一，鑒定大豆新品種實現(xiàn)大豆高產(chǎn)、優(yōu)質(zhì)、高效，為國家大豆新品種審定推廣提供依據(jù)。

充分了解試驗大豆品系的遺傳多樣性和品系純度，對于新品種審定、保護(hù)及種質(zhì)材料評價等具有重要意義。傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)標(biāo)記對大豆品種的鑒定，不能對其基因DNA遺傳進(jìn)行深入研究。SSR標(biāo)記因標(biāo)記數(shù)量豐富、操作簡便、結(jié)果重復(fù)性好，被廣泛應(yīng)用于作物品種的鑒別研究。張博等[1]利用18個SSR引物對來自6個?。ㄊ校┑?0個育成大豆品種進(jìn)行遺傳分析，根據(jù)遺傳距離將10個親本聚為兩類，平均遺傳距離為0.835。秦君等[2]利用60個SSR標(biāo)記對黑龍江省140份代表性大豆種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，在遺傳距離為0.24時，將參試品種分為兩大類群。樸向民等[3]利用9對多樣性較高的SSR引物對來自中國吉林?。?6份）和韓國（10份）的野生大豆材料進(jìn)行遺傳多樣性分析，在遺傳相似系數(shù)為0.68的水平上，將76份材料分為兩大類群。關(guān)榮霞等[4]利用SSR標(biāo)記對4個品種材料進(jìn)行純度檢測驗證，發(fā)現(xiàn)品661純度最高，達(dá)到了99.0%。關(guān)榮霞等[5]利用30對SSR引物對2005～2009年參加國家區(qū)域試驗的1 068份大豆品種進(jìn)行位點純合度檢測發(fā)現(xiàn)，位點純合度低的品種，在區(qū)域試驗中產(chǎn)量也較低。楊凱敏等[6]利用59個SSR標(biāo)記對90份大豆種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，在遺傳距離0.805處將90份材料分為了三大類群。徐海風(fēng)等[7]利用6對SSR引物對26份菜用大豆構(gòu)建了指紋圖譜，26份菜用大豆品種（系）間遺傳相似系數(shù)的變異范圍為0.61～0.88。何琳等[8]利用5對引物SSR標(biāo)記對94份北方春大豆國家區(qū)試品種構(gòu)建了指紋圖譜，純度分布范圍為53.85%～100.0%，平均純度為99.02%，平均遺傳相似系數(shù)為0.278 3。賈艷曉[9]利用30對SSR引物和10對AFLP引物構(gòu)建了41個河北省大豆推廣品種的DNA指紋圖譜。

前人研究中，關(guān)于河北省區(qū)域試驗大豆品系指紋圖譜構(gòu)建、遺傳相似性分析及純度鑒定的報道較少。為有效指導(dǎo)河北省大豆新品種的選育和推廣，以參加2016年河北省區(qū)域試驗的21份大豆品系為試材，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)鑒定參試大豆品系的純度、構(gòu)建指紋圖譜，為品種純度、真?zhèn)舞b定和新品種保護(hù)提供理論依據(jù)，從而維護(hù)育種者的品種權(quán)和消費者的利益；分析參試大豆品系間遺傳相似性，明確大豆品種間親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，為親本選配、后代選擇及雜種優(yōu)勢水平的預(yù)測提供指導(dǎo)[10]。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為參加2016年河北省大豆區(qū)域試驗的21個品系（表1）。每份材料均取30粒種子，在營養(yǎng)缽中用蛭石發(fā)芽，待真葉展開后，從20個單株上各摘取1片真葉，放入2 mL離心管中，液氮保存，備用。

表1 2016年河北省大豆區(qū)域試驗的21個品系Table 1 21 soybean lines in the regional test of Hebei Province in 2016

1.2 試驗方法

1.2.1 SSR引物篩選 參照全基因組測序開發(fā)的SSR標(biāo)記（https：//www.soybase.org/）。從20條染色體隨機選取62對SSR引物對21份大豆品系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從中篩選出PCR產(chǎn)物條帶清晰的引物對21份大豆品系進(jìn)行指紋圖譜構(gòu)建和純度檢測。

1.2.2 DNA的提取及SSR擴(kuò)增 采用CTAB法[11]提取基因組DNA，利用NanoDrop 2000超微量分光光度儀測定其濃度，采用瓊脂糖凝膠電泳檢測模板DNA質(zhì)量。將DNA樣品稀釋到30 ng/μL，4℃冰箱保存，備用。

利用德國BIOMETRO PCR儀進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性30 s，55℃退火30s，72℃延伸30s；重復(fù)步驟2～4，共36個循環(huán)；72℃延伸10 min，4℃保存。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在6%聚丙烯酰胺凝膠上用1/3×TBE緩沖液進(jìn)行電泳分離，銀染，氫氧化鈉和甲醛顯色。拍照并記載位點。

1.2.3 統(tǒng)計分析 根據(jù)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的結(jié)果，視每對SSR引物為1個位點，每條多態(tài)性帶為1個等位基因；在相同遷移率位置上，有帶記為“1”，無帶記為“0”，缺失記為“9”；按Nei等[12]方法計算遺傳相似系數(shù)（GS）和遺傳距離（GD）：

式中，Mxy為品系x和品系y在所有檢測位點上共有片段的數(shù)目（個），Mx為品系x在所有檢測位點上的總片段數(shù)（個），My為品系y在所有檢測位點上的總片段數(shù)（個）。

根據(jù)遺傳相似性系數(shù)，利用SAHN程序[13]和非加權(quán)類平均法（UPGMA）[14]對遺傳相似性進(jìn)行聚類，并繪制樹狀圖。根據(jù)Smith等[15]方法，計算每對SSR引物的多態(tài)性信息含量指數(shù)（PIC）：

式中， ∫i表示第i位點的等位基因頻率。

參照中華人民共和國農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《大豆品系純度鑒定技術(shù)規(guī)程》（NY/T 1788—2099），如果SSR位點出現(xiàn)單一條帶，說明品系純合；如果出現(xiàn)2個或多個條帶的位點，則認(rèn)為該品系在該位點雜合。根據(jù)公式計算品系純度（P）：

式中，P為品系純度（%），S1為檢測SSR位點數(shù)（個），S2為雜合位點數(shù)（個）。

2 結(jié)果與分析

2.1 SSR標(biāo)記多態(tài)性及指紋圖譜構(gòu)建

選取62對SSR引物對21份大豆品系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，篩選出具有多態(tài)性豐富、條帶清晰的引物19對，共擴(kuò)增片段大小為300～1 000 bp的DNA條帶93條，每對引物擴(kuò)增的條帶數(shù)為3～8條，平均5.50條，其中，多態(tài)性DNA條帶73條，多態(tài)性比率為78.50%。SSR引物的PIC值變幅為0.44～0.88，其中Satt255的PIC值最高、Satt174的PIC值最低，平均值為0.67。

通過統(tǒng)計分析，選取條帶清晰且PIC值高的3對SSR引物對21個大豆品系的DNA指紋圖譜進(jìn)行構(gòu)建。這3對引物共擴(kuò)增出21條DNA條帶，其中16條為多態(tài)性條帶，平均PIC值為0.78（表2）。進(jìn)一步將3對引物對21個品系指紋圖譜加以數(shù)字化，形成矩陣（表3）。分別單獨利用SSR引物Satt216、Satt175和Satt125，根據(jù)帶型組合，可以將21個品系分成9、9和6種類型。利用引物組合Satt216與Satt175可以將21個品系中的15個品系精確區(qū)分，利用Satt216與Satt125可以將21個品系中的13個品系精確區(qū)分，利用引物組合Satt125與Satt175可以將21個品系中的12個品系精確區(qū)分，聯(lián)合應(yīng)用這3對引物可以將21個品系中的每一個品系精確區(qū)分。

表2 SSR分析結(jié)果Table 2 Results of SSR analysis

2.2 遺傳相似性分析

利用SNTSYS-pc 2.1軟件[16]對21個大豆品系19對SSR引物檢測到的93個位點進(jìn)行聚類分析，建立聚類樹狀圖（圖1）。品系間遺傳相似系數(shù)變幅為0～8.20，平均值為0.63，遺傳相似系數(shù)的變異范圍為0.61～0.82。以遺傳相似系數(shù)0.64為閾值可以將21份品系分為3個群，其中，第一類群僅包含石641，第二類群包含邯11-114、石豆14和冀1504等16個品系，第三類群包含滄豆13、滄豆11和滄豆0734等4個品系。由此可見，21個大豆品系間的遺傳變異較小，遺傳相似性高。

2.3 種子純度檢測

利用篩選的2對SSR引物（Satt216、Satt114）對21個大豆品系的420粒種子（每品系均20粒）進(jìn)行純度檢測，結(jié)果（表4）顯示，純度100%的品種有11個，分別是石641、冀1503、邯13-99、滄豆11、冀1514、農(nóng)大鑒1501、石76368、HN0906、邯11-222、石153和冀13BB9；純度97%的品種僅1個，是滄豆13；純度95%的品種有5個，分別是邯11-114、冀1504、冀1507、滄豆0734和邯12-383；純度90%的品種有3個，分別是HN0811、邯12-298和石豆14；純度低于90%的品種僅1個，是石豆15，其純度為85%。21個大豆品系種子純度的分布范圍為85%～100%，平均純度97%。

表3 利用3個標(biāo)記對21個大豆品系構(gòu)建的DNA指紋圖譜Table 3 DNA fingerprints of 21 soybean lines with 3 SSR markers

圖1 21個大豆品系的SSR標(biāo)記遺傳聚類圖Fig.1 Dendrogram of 21 soybean lines based on SSR genetic distance

3 結(jié)論與討論

本研究結(jié)果顯示，品種指紋圖譜的構(gòu)建可以為品種鑒別提供理論依據(jù)。根據(jù)各品種指紋的不同進(jìn)行聚類分析，可以了解品種間的親緣關(guān)系和遺傳距離，為培育新品種提供參考。利用多態(tài)性豐富、條帶清晰的3對SSR引物（Satt216、Satt175和Satt125）構(gòu)建的指紋圖譜即可將21個大豆品系完全區(qū)分；通過對參加2016年河北省區(qū)域試驗的21份品系進(jìn)行遺傳相似性分析發(fā)現(xiàn)，品系間遺傳相似系數(shù)變幅為0～8.20，平均0.63，遺傳相似系數(shù)的變異范圍為0.61～0.82。以遺傳相似系數(shù)0.64為閾值可以將21份品系分為3個群，其中，第一類群與其他2種類群中品種的遺傳相似性系數(shù)均為0，其他2個類群品種的遺傳相似系數(shù)范圍為0.61～0.82。遺傳相似度較高，說明品種間遺傳變異較小。這可能與不同育種單位組配雜交組合時選用的親本材料遺傳背景比較相近相關(guān)，在一定程度上導(dǎo)致大豆遺傳基礎(chǔ)比較狹窄。

表4 21個大豆品系種子純度檢測結(jié)果Table 4 Purity of 21 soybean lines

Xie等[17]利用67對SSR引物對158份中國夏季大豆進(jìn)行遺傳多樣性分析，中國夏季大豆品種的遺傳相似性系數(shù)分布范圍為0.41～0.91，平均0.74；黃淮海地區(qū)夏季大豆品種的遺傳相似性系數(shù)分布范圍為0.39～0.89，平均0.71；南方地區(qū)夏季大豆品種的遺傳相似性系數(shù)分布范圍為0.19～0.88，平均0.69。賈曉艷等[18]利用30對SSR引物對41個大豆品種進(jìn)行擴(kuò)增后檢測出135個等位變異，SSR的遺傳多樣性指數(shù)變化范圍為0.09～0.78，平均0.64。10對AFLP引物擴(kuò)增出93個多態(tài)性標(biāo)記，品種間的遺傳相似系數(shù)分布范圍為0.59～0.99，平均值0.72，遺傳相似系數(shù)較高。徐海風(fēng)等[19]利用45對引物對大豆品種的遺傳相似性進(jìn)行分析，43份大豆品種的遺傳相似系數(shù)分布范圍為0.56～0.96。楊加銀等[20]利用46對SSR引物對3個淮豆系列品種及8份骨干親本品種，采用非加權(quán)平均法聚類分析，遺傳相似系數(shù)為0.58～0.96。本研究結(jié)果顯示，參加2016年河北省區(qū)域試驗的21個大豆品系遺傳相似系數(shù)均比較大，與上述研究結(jié)果比較相似。因此，了解參試大豆品種的遺傳背景可減少親本選配的盲目性，為利用種質(zhì)資源進(jìn)行育種工作提供參考依據(jù)。

本研究中，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)對2016年河北省區(qū)域試驗的21個大豆品系進(jìn)行種子純度鑒定，結(jié)果顯示，品種純度分布范圍為85%～100%，平均純度97%，其中，純度高于90%的品種有20個。有1個品種純度低于90%，這可能是因為大田異花授粉出現(xiàn)雜株，或是因為育種世代等原因，導(dǎo)致某些SSR等位變異；也可能是微衛(wèi)星在復(fù)制過程中出現(xiàn)變異[21]，致使純度鑒定僅在分子水平上難以判斷。由于標(biāo)記密度的影響，在形態(tài)學(xué)上鑒定出的雜株不一定在分子水平上能鑒定出是雜株，而在形態(tài)學(xué)上的正常株卻有可能在分子水平上被鑒定成雜株[22]。因此，對于參試的大豆品系應(yīng)該從形態(tài)學(xué)和分子水平兩方面相結(jié)合來鑒定，以確保參試材料純度的準(zhǔn)確性。

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