草魚養(yǎng)殖池噬菌蛭弧菌的分離與鑒定

陳煜安

摘要：利用雙層平板法，以嗜水氣胞菌（Aeromonas hydrophila）為宿主菌，從草魚養(yǎng)殖池水中分離蛭弧菌一株；根據(jù)蛭弧菌hit基因序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所得產(chǎn)物經(jīng)膠回收、測(cè)序比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其序列與噬菌蛭弧菌的hit基因100%同源，表明本研究所分離得到的為噬菌蛭弧菌（Bdellovibrio bacteriovorus）。

關(guān)鍵詞：蛭弧菌；噬菌蛭弧菌；分離；鑒定；PCR

噬菌蛭弧菌（Bdellovibrio bacteriovorus），是一類由Stolp和Petzold于1962年首次發(fā)現(xiàn)的、原核生物界唯一一類周質(zhì)型專性捕食性細(xì)菌。其體形小，在土壤、淡海水、污水等不同環(huán)境中分布廣泛，且運(yùn)動(dòng)活潑，具有“寄生”和“裂解（溶菌）”宿主菌的生物學(xué)特性。

養(yǎng)殖概論

近年來，隨著集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的進(jìn)一步發(fā)展，以及養(yǎng)殖水體的污染，嗜水氣單胞菌等革蘭氏陰性病原菌對(duì)草魚等水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物造成了嚴(yán)重的危害。蛭弧菌能寄生和裂解大多數(shù)種類的革蘭陰性菌。鑒于這一特性，噬菌蛭弧菌受到了國(guó)內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注，逐漸成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中一種良好的微生態(tài)制劑，在農(nóng)業(yè)、工業(yè)和醫(yī)學(xué)等不同領(lǐng)域均顯示出了廣闊的應(yīng)用前景。

本研究利用雙層平板法從草魚養(yǎng)殖池水中分離得到蛭弧菌一株，根據(jù)噬菌斑形成等對(duì)其進(jìn)行初步的鑒定，同時(shí)根據(jù)蛭弧菌的host interaction（hit）基因序列設(shè)計(jì)了特異性引物，從分子水平上對(duì)該菌株進(jìn)行了鑒定，確定該菌為噬菌蛭弧菌。為該菌應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病防治等理論研究與實(shí)踐應(yīng)用提供了基礎(chǔ)資料。

材料與方法

水樣 采自紹興皋埠鎮(zhèn)某草魚養(yǎng)殖池，用采水器從底部取水，裝于50mL滅菌的離心管中。

宿主菌株 以本實(shí)驗(yàn)室分離自患病草魚并保存的嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）為宿主菌。

培養(yǎng)基 ①雙層培養(yǎng)基：上層為0.6%自來水瓊脂，用于蛭弧菌篩選、分離和純化；下層為1.5%自來水瓊脂；②普通營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（NB）；③浸出液：蛋白胨10g，牛肉膏3g，氯化鈉15g，蒸餾水加至1000mL，pH7.0。

主要試劑 Taq酶、dNTPs購(gòu)自上海生工產(chǎn)品；DNA回收試劑盒購(gòu)自愛思進(jìn)；pGMT載體、大腸桿菌感受態(tài)等均購(gòu)自天根公司；其他為國(guó)產(chǎn)分析純。

噬菌蛭弧菌的分離與鑒定 第一，宿主菌懸液的制備。將宿主菌嗜水氣單胞菌接種于NB平板上，30℃過夜培養(yǎng)，刮取、無菌水洗脫細(xì)菌并收集于5mL離心管中，10000g，室溫離心2min，去上清液，加入3mL無菌水制備成懸液，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

第二，蛭弧菌的分離與純化。①樣品處理：取池水，經(jīng)八疊紗布過濾，將澄清液置超速冷凍離心機(jī)中離心（4℃，30000g，40min）；沉淀用5mL無菌水溶解，再經(jīng)0.22μm濾膜過濾后備用；②蛭弧菌的分離、純化：取1mL濾液加入2mL的宿主菌懸液，混勻；然后加入7mL滅菌并保持在48℃左右的0.6%自來水瓊脂培養(yǎng)基，搖勻后倒至經(jīng)滅菌的1.5%自來水瓊脂固體培養(yǎng)基上。30℃下倒置培養(yǎng)，觀察噬菌斑的形成；經(jīng)2至4d的培養(yǎng)后，挖取平板上透明、圓形和整齊的單個(gè)噬菌斑，置于NB液體培養(yǎng)基的離心管中，浸泡10min以上；用浸出液做雙層平板，重復(fù)傳代3次以上獲得純化的蛭弧菌。

第三，蛭弧菌的PCR鑒定。在結(jié)合以上噬菌斑進(jìn)行鑒定的基礎(chǔ)上，根據(jù)相關(guān)知識(shí)及GenBank中蛭弧菌host interaction（hit）基因的序列，利用Oligo 6.5軟件設(shè)計(jì)了特異性引物：BDhitf：5'-GTGGCTTCAAACGGAGTGGA-3，BDhitr：5'-ACGACTGTGAACGGCAACG-3。PCR擴(kuò)增體系為：DNA模板（噬菌斑浸出液）2.0μL，Taq酶0.2μL，dNTPs 0.4μL，10×PCR緩沖液2.5μL，引物各1.0μL，水17.9μL。循環(huán)參數(shù)為：95℃預(yù)變性4min；94℃變性40sec，56℃退火25sec，72℃延伸1min，35個(gè)循環(huán)；72℃再延伸10min。瓊脂糖凝膠電泳檢查擴(kuò)增結(jié)果，PCR產(chǎn)物經(jīng)割膠回收后，與T載體連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞；陽性克隆經(jīng)鑒定后送上海生工測(cè)序，用blast和ClustalW2軟件進(jìn)行序列比對(duì)分析。

結(jié)果與分析

蛭弧菌的分離結(jié)果 采用雙層瓊脂平板法，以嗜水氣單胞菌為宿主菌，通過濾膜過濾的方法收集草魚養(yǎng)殖池水池培養(yǎng)蛭弧菌。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，從第2d起開始形成大小相似、直徑約0.1至0.25cm的圓形、透明、邊緣整齊、凹陷的噬菌斑“負(fù)菌落”；3d后出斑率較高，直至7d左右，其大小總體上隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而增大，顯示所分離的蛭弧菌具有明顯的噬菌作用。挑選特征典型的噬菌斑進(jìn)行傳代，經(jīng)4次傳代后得到蛭弧菌一株，記為BD-sx1（圖1）。

蛭弧菌的PCR鑒定 在利用噬菌斑等形態(tài)學(xué)指標(biāo)和噬菌特性對(duì)本研究過分離到的蛭弧菌進(jìn)行初步觀察與鑒定的基礎(chǔ)上，本研究根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道及GenBank中蛭弧菌host interaction（hit）基因的序列設(shè)計(jì)了特異性引物，以宿主嗜水氣單胞菌和大腸桿菌DH5α為陰性對(duì)照，進(jìn)行了PCR擴(kuò)增反應(yīng)。結(jié)果顯示，只有蛭弧菌菌株BD-sx1中獲得了近800 bp的擴(kuò)增條帶，大小與預(yù)期相符（圖2）。進(jìn)而，本研究對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行了割膠回收，純化產(chǎn)物與T載體連接后，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)經(jīng)鑒定后的陽性克隆進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果blast和Clustal W2軟件與GenBank中已知的蛭弧菌hit基因序列進(jìn)行比對(duì)了分析。比對(duì)結(jié)果表明，所得基因序列與噬菌蛭弧菌的hit基因序列100%相似（圖3），進(jìn)一步證明本研究所分離、純化到的蛭弧菌菌株BD-sx1為噬菌蛭弧菌（B.bacteriovorus）。

討論

培養(yǎng)基及其濃度 培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分與宿主菌、蛭弧菌以及其他雜菌的生長(zhǎng)密切相關(guān)。Stolp等在1963年就提出經(jīng)稀釋的低營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基不利于宿主菌的生長(zhǎng)而有利于蛭弧菌的生長(zhǎng)。因此，在分離、純化蛭弧菌時(shí)應(yīng)使用低營(yíng)養(yǎng)成分的培養(yǎng)基。Staples等比較了不同濃度稀釋度的培養(yǎng)基從水樣中分離蛭弧菌的效果，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高度稀釋的培養(yǎng)基分離效果最佳。司稚東等研究發(fā)現(xiàn)，在1/10胨肉膏和酵母膏培養(yǎng)基上可形成蛭弧菌噬菌斑，但同時(shí)雜菌生長(zhǎng)更快、菌落多，蛭弧菌噬菌斑易被其遮蓋；而2%的自來水瓊脂培養(yǎng)基上雜菌少、噬菌斑明顯、清晰，更適于分離蛭弧菌。本研究分離純化結(jié)果也顯示，用低營(yíng)養(yǎng)成分的自來水瓊脂培養(yǎng)基分離蛭弧菌效果較好；同時(shí)，與司稚東等相比，瓊脂使用濃度更低，僅用1.5%的瓊脂也可取得良好分離效果。

雙層瓊脂平板法是蛭弧菌分離的經(jīng)典方法，但在使用該方法時(shí)應(yīng)注意上層培養(yǎng)基的溫度應(yīng)該控制在45-48℃左右，同時(shí)掌握好倒平板的時(shí)機(jī)。溫度過高，宿主菌和水樣中待分離的蛭弧菌可能會(huì)被燙死；溫度過低，上層培養(yǎng)基易凝固，容易導(dǎo)致倒出的平板不平整，宿主菌和蛭弧菌難以均勻分布，最終導(dǎo)致噬菌不清晰，影響分離效果。

蛭弧菌的鑒定 傳統(tǒng)的蛭弧菌的鑒定可根據(jù)噬菌斑形態(tài)、革蘭氏染色、接觸酶抑制、寄生性、菌體形態(tài)的顯微觀察等方法來進(jìn)行，但上述方法存在特異性差、易受宿主菌干擾、有些較為繁瑣等缺點(diǎn)，且容易產(chǎn)生誤判。而本研究根據(jù)蛭弧菌hit基因序列設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并結(jié)合測(cè)序比對(duì)和生物信息學(xué)鑒定，具有快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，與傳統(tǒng)的噬菌斑形態(tài)觀察、寄生性、革蘭氏染色、顯微鏡觀察等相結(jié)合，可從不同角度、不同層次進(jìn)行蛭弧菌的鑒定，利用分子鑒定提高準(zhǔn)確性，以更好地滿足理論研究與實(shí)踐應(yīng)用的需要。

蛭弧菌微生態(tài)制劑在草魚等水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用前景 草魚是我國(guó)的大宗魚類、當(dāng)家品種之一，但草魚等“四大家魚”的病害頻發(fā)。傳統(tǒng)的抗生素和化學(xué)藥物治療已難以適應(yīng)國(guó)內(nèi)外消費(fèi)者對(duì)綠色無公害水產(chǎn)品質(zhì)量安全的要求，因此，發(fā)展蛭弧菌等微生態(tài)制劑是符合可持續(xù)發(fā)展和環(huán)境要求的重要發(fā)展方向。鑒于蛭弧菌株獨(dú)特的“寄生”和“裂解（溶菌）”病原菌的生物學(xué)特性，作為一種益生菌，蛭弧菌微生態(tài)制劑取代抗生素藥物用于草魚等水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)和廣闊的發(fā)展前景。

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（作者單位：浙江省紹興市柯橋區(qū)魯迅中學(xué)）