香豆素類比率熒光探針的合成及其對亞硫酸鹽與硫化氫的區(qū)分檢測

姚余華,田海玉,裴曉良,陳 揚,張維冰,錢俊紅

(上海市功能性材料重點實驗室,華東理工大學 化學與分子工程學院,上海 200237)

含硫化合物如亞硫酸鹽、硫化氫和硫醇是常用的化學試劑[1-3],在環(huán)境和生物領(lǐng)域亦發(fā)揮著不同的作用[4-5]。亞硫酸鹽能有效防止食物氧化變質(zhì)，是一種常見的食品添加劑、藥物保鮮劑和防腐劑[6-8]。在生物體內(nèi)，亞硫酸鹽參與很多重要的生理過程，例如調(diào)節(jié)心血管功能和提高細胞的抗氧化能力[9-11]。然而，過量攝入亞硫酸鹽會對人體造成傷害，嚴重時可能引發(fā)某些疾病。因此，許多國家制定了相應標準控制食品、藥品中亞硫酸鹽的含量。H2S是繼NO和CO之后的第3種氣體信號分子[12-13]，具有重要的生物活性，可參與有機體的多種生理、病理過程，如調(diào)節(jié)神經(jīng)傳遞、抑制胰島素分泌等[14]，其濃度異?？赡芘c哮喘、胃腸痛等多種疾病有關(guān)。因此，建立快速、靈敏、高選擇性地檢測上述含硫物質(zhì)的分析方法對食品安全、疾病診斷等具有重要意義[15]。熒光檢測法因靈敏度高、選擇性好和響應速度快等優(yōu)點在分析化學領(lǐng)域備受關(guān)注?；诤蚧衔锱c金屬離子的絡合作用[16]、親核活性[17]、還原作用[18]以及與醛基反應[19]等特性，科學工作者設計合成了很多熒光探針用于此類物質(zhì)的檢測。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

紫外可見分光光度計(美國Thermo Fisher Scientific,Evolution 220),熒光光譜儀(美國Thermo Fisher Scientific,Lumina),核磁共振波譜儀(瑞士Bruker公司,AV-400)，質(zhì)譜儀(美國,MA 1212),超純水儀(德國Sartorius)；所用藥品均購自上海凌峰化學試劑有限公司或阿拉丁試劑上海有限公司，所用試劑均為分析純，實驗用水為超純水。

1.2 探針合成

1.2.1化合物m1的合成根據(jù)文獻的方法合成得到中間體m1[20]。

1.2.2化合物m2的合成在100 mL圓底燒瓶中加入苯乙酮(0.024 mol,2.8 mL)、丙二腈(0.024 mol,1.59 g)、醋酸銨(0.2 mol,0.37 g)、冰醋酸(1.1 mol，1.5 mL)和甲苯(20 mL)，將反應液加熱回流1 h后冷卻至室溫，再用150 mL飽和碳酸氫鈉溶液和50 mL水依次洗滌后，旋蒸除去溶劑，所得固體用無水乙醇重結(jié)晶，得到白色固體m2(2.41 g,60%)。1H NMR(CDC13,400 MHz)δ(ppm):2.65(s,3 H),7.54(m,5 H)。

圖1 探針MSP的合成路線Fig.1 The synthesis procedures of probe MSP

1.2.3探針MSP的合成將1 mL吡咯烷滴加至溶有1.0 gm1(3.72 mmol) 和1.8倍當量m2的50 mL CH2Cl2/EtOH(體積比為1∶1)溶液中。將混合液在室溫下攪拌10 h后減壓去除溶劑，所得固體用硅膠柱(DCM/EA=2∶1)分離后得到深黑色晶體即為探針MSP(0.75 g，48%),其合成路線見圖1。1H NMR(CDC13,400 MHz)δ(ppm):1.97(m,4 H),2.76(t,2 H,J=6.10 Hz),2.86(t,2 H,J=6.35 Hz),3.35(q,4 H),6.91(m,2 H),7.34(d,1 H),7.36(d,1 H),7.44(m,1 H),7.52(m,3 H),7.70(s,1 H),7.88(d,1 H)。HR-MSm/z:420.170 7(M+H)+,C23H21N2O3+理論計算值:420.163 4(M+H)+。

1.3 溶液配制

準確稱取MSP溶于DMF中，配制3 mmol/L MSP儲備液；準確稱取Na2SO3和Na2S分別溶于一定體積的PBS(20 mmol/L,pH 7.4)緩沖溶液中，配制成30 mmol/L的Na2SO3或Na2S儲備液；按上述方法配制30 mmol/L的其他分析物儲備液。

1.4 滴定實驗

準確量取10 μL探針儲備液于3 mL PBS中配成10 μmol/L的探針溶液，再加入不同體積的Na2SO3或Na2S儲備液，得到一系列不同濃度的待測樣品溶液。放置10 min(Na2SO3)或3 h(Na2S)后測試體系的吸收和發(fā)射光譜。

1.5 細胞實驗

移取200 μL L929細胞液于2 mL細胞培養(yǎng)皿中，將其置于37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中，用2 mL含10%胎牛血清的Dulbecco’s改良培養(yǎng)基(DEME)培養(yǎng)24 h。此后，用無菌PBS(20 mmol/L，pH 7.4)沖洗細胞3次，再用含有10 μmol/L探針MSP的無血清DEME培養(yǎng)基培養(yǎng)30 min。Na2SO3或Na2S測試實驗中，在細胞用無菌PBS沖洗3次前，先用含0.5 mmol/L Na2SO3/Na2S的無血清DEME培養(yǎng)基培養(yǎng)30 min/3 h，后續(xù)操作與前述一致。最后，幾個試樣均用無菌PBS沖洗3次后進行熒光成像。在488 nm激發(fā)波長下，同時采集綠色通道(500～550 nm)和紅色通道(662～737 nm)的熒光信號。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針對亞硫酸鹽及硫化氫的光譜響應

由圖2可知，探針MSP的最大吸收和發(fā)射波長分別位于572 nm和690 nm(圖2A～B)，較長的發(fā)射波長使其在實際樣品檢測中具有潛在應用。為研究探針對含硫化合物的光譜響應，首先測試了PBS-DMF緩沖溶液中(20 mmol/L,pH 7.4,體積比1∶2)亞硫酸鹽與探針混合體系的吸收光譜隨時間的變化曲線。由圖2A可知，亞硫酸鹽的加入使得探針MSP在572 nm處的吸收峰強度迅速降低，同時在464 nm處產(chǎn)生一個新的吸收峰，后者的吸光度在2 min內(nèi)達到最大值，且在484 nm處出現(xiàn)一個等吸收點，表明該體系中生成了新的化合物，此時溶液顏色由橙紅色變成淡黃色。同時，探針MSP在 690 nm處的發(fā)射峰迅速降低并在510 nm處出現(xiàn)了一個新的發(fā)射峰(圖2B)；在熒光燈照射下，溶液的顏色由紅色變?yōu)樗{綠色。隨后，又研究了探針MSP對硫化氫的光譜響應(圖2C～D)，與亞硫酸鹽類似，硫化氫的加入亦使得探針的吸收和發(fā)射波長明顯藍移，但MSP-H2S體系的光譜變化較為緩慢。從圖2E可以更直觀地看出，當反應時間延長至3 h時，MSP-H2S體系的光譜變化才趨于平衡，在反應時間為10 min時，該體系的光譜變化較小，而MSP-Na2SO3體系已達到平衡。值得注意的是，當探針MSP與硫化氫的反應時間達3 h時，探針在510 nm處的熒光強度急劇增大，其與690 nm處的熒光強度相比(I510/I690)增加了260倍(圖2F)，遠高于亞硫酸鹽對探針熒光光譜的影響。上述結(jié)果表明，該探針對亞硫酸鹽和硫化氫的響應速度不同，且兩種含硫化合物對探針的熒光光譜影響也有明顯差異。因此，可利用反應動力學和熒光強度的變化實現(xiàn)對亞硫酸鹽和硫化氫的區(qū)分檢測。

2.2 探針對亞硫酸鹽及硫化氫的選擇性與競爭性

測試了其他潛在干擾物(多種陰離子與生物硫醇)與亞硫酸鹽/硫化氫共存時對探針MSP的光譜影響。結(jié)果顯示，上述干擾物幾乎不干擾探針對亞硫酸鹽和硫化氫的檢測，表明探針MSP具有良好的選擇性和競爭性，可用于對實際樣品中亞硫酸鹽和硫化氫的檢測。

2.3 亞硫酸鹽與硫化氫濃度對探針光譜性質(zhì)的影響

線性范圍和檢出限是探針定量檢測的重要指標。分別選擇反應時間為10 min和3 h研究了亞硫酸鹽(圖5A)和硫化氫(圖5B)濃度對探針MSP吸收/發(fā)射光譜的影響。由圖5A可知，隨著亞硫酸鹽濃度的增大，探針在572 nm處的吸光度值逐漸降低，464 nm處產(chǎn)生一新的吸收峰且其強度隨亞硫酸鹽濃度的增加而逐漸增大，當亞硫酸鹽濃度達到400 μmol/L時，探針溶液的吸收光譜幾乎不變。以探針在464 nm和572 nm處的吸收強度比(A464/A572)對亞硫酸鹽濃度作圖可知，在0～200 μmol/L濃度范圍內(nèi)，A464/A572與亞硫酸鹽濃度呈良好的線性關(guān)系(r2=0.984 3)，其對亞硫酸鹽的檢出限(3σ/k)為0.95 μmol/L。當反應時間為3 h時，在0～500 μmol/L濃度范圍內(nèi)，I510/I690與硫化氫濃度呈線性關(guān)系(r2=0.993 7)，對硫化氫的檢出限(3σ/k)為0.6 μmol/L。以上結(jié)果表明探針MSP在亞硫酸鹽和硫化氫高選擇性、高靈敏度定量方面有潛在應用價值。

2.4 探針對亞硫酸鹽及硫化氫的細胞成像

將探針MSP用于對L929細胞中亞硫酸鹽和硫化氫的熒光成像，結(jié)果如圖6所示。當細胞僅用探針MSP培養(yǎng)后，在紅色通道顯示較強的熒光，而綠色通道幾乎沒有熒光(圖6A～D)。當L929細胞先用Na2SO3培養(yǎng)30 min后再用探針MSP培養(yǎng)30 min，可觀察到細胞內(nèi)綠色熒光略有增強，同時紅色熒光明顯降低(圖6E～H)；當L929細胞先用Na2S培養(yǎng)3 h再用探針培養(yǎng)30 min后，細胞內(nèi)觀察到很強的綠色熒光，而紅色熒光顯著降低(圖6I～L)。上述結(jié)果表明，探針MSP在區(qū)分檢測活細胞內(nèi)亞硫酸鹽和硫化氫方面有潛在應用價值。

圖6 L929細胞的熒光成像圖Fig.6 Fluorescence imaging of L929 cellsA-D:L929 cells incubated with MSP for 30 min(用探針MSP培養(yǎng)30 min);E-H:L929 cells were pretreated with Na2SO3 for 30 min then incubated with MSP for further 30 min(L929細胞先用Na2SO3培養(yǎng)30 min再用探針MSP培養(yǎng)30 min);I-L:L929 cells were pretreated with Na2S for 3 h then incubated with MSP for another 30 min(L929細胞先用Na2S培養(yǎng)3 h再用探針MSP培養(yǎng)30 min)；A,E,I:green channel obtained from 500-550 nm;B,F,J:red channel obtained from 662-737 nm;C,G,K:bright field;D,H,L:merged imaging;[MSP]=10 μmol/L,[Na2SO3]=0.5 mmol/L,[H2S]=0.5 mmol/L,excited at the 488 nm

3 結(jié) 論

本文基于亞硫酸鹽與硫化氫親核活性的差異，設計合成了一個香豆素類比率熒光探針MSP用于對兩者進行區(qū)分檢測。通過將強吸電子基團二氰基亞甲基苯共軛連接到香豆素熒光團上，使得探針具有較長的吸收和發(fā)射波長(λab=572 nm，λem=690 nm)以及較高的反應活性。該探針可實現(xiàn)對亞硫酸鹽的快速、比色響應以及對硫化氫的比率熒光響應,并可用于活細胞內(nèi)亞硫酸鹽和硫化氫的熒光成像。

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