激光解吸電離傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜用于食用油的快速分析

李衛(wèi)峰，楊秋霞，林澤鵬，管 鵬,2，郭鵬然*

(1.廣東省測試分析研究所 廣東省化學危害應急檢測技術(shù)重點實驗室 廣東省原位電離質(zhì)譜分析工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州 510070； 2.蘭州理工大學 石油化工學院，甘肅 蘭州 730050)

食用油是人們?nèi)粘Ｉ钪斜夭豢缮俚臓I養(yǎng)成分，其化學組成包括甘油三酯、甘油二酯、脂肪酸、甾醇、酚類等，其中，甘油三酯(Triacylglycerols，TAGs)是食用油的主要成分(占95%以上)。TAGs由甘油和3個脂肪酸酯化而成[1]，由于脂肪酸分為飽和脂肪酸(Saturated fatty acid)、單不飽和脂肪酸(Monounsaturated fatty acid)和多不飽和脂肪酸(Polyunsaturated fatty acid)，最終形成的甘油三酯種類十分龐大，所以不同種類的食用油因含有的TAGs成分不同，其營養(yǎng)價值有很大的差異。據(jù)報道，甘油三酯中的脂肪酸組成及含量與多種疾病相關(guān)(如冠心病、心腦血管疾病和老年癡呆癥等[2-3])，因此在飲食搭配過程中合理選擇食用油品種至關(guān)重要。但不同種類食用油外觀及組成高度相似，以次充好、食用油摻假現(xiàn)象頻繁發(fā)生，極大地影響了食用油品行業(yè)的健康安全發(fā)展。因此，開發(fā)快速、直接分析食用油中甘油三酯的方法對有效監(jiān)控食用油質(zhì)量和保障食用油安全具有重要意義。

目前，食用油的分析方法主要包括紅外光譜法、色譜法、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法及直接進樣質(zhì)譜法[4-8]。其中，直接進樣質(zhì)譜法因具有易操作、分析速度快、高通量等特點而成為分析食用油中TAGs的前沿手段之一。當前用于食用油中TAGs直接分析的離子源種類多樣，包括基質(zhì)輔助激光解吸電離源(MALDI)[9-10]、電噴霧離子源(ESI)[11-12]、解吸附電噴霧離子源(DESI)、大氣壓化學電離源(APCI)等[13-16]。與其他離子源相比，MALDI源可以避免樣品純化或化學修飾等預處理過程，具有樣品制備方便、易操作、耐鹽度好的優(yōu)點，已被廣泛應用于食用油的快速篩查分析。但是，MALDI離子源也有自身缺陷，如低質(zhì)量數(shù)的區(qū)域易受基質(zhì)峰干擾、質(zhì)譜圖重現(xiàn)性受制于基質(zhì)結(jié)晶的均勻程度。為解決這些難題，涌現(xiàn)了多種新型的樣品制備手段，如Picariello等[17]在不銹鋼樣品靶上預沉積硝化纖維層后可以獲得重復穩(wěn)定的TAGs信號，并且顯著降低了碎片離子峰強度。Park等[18]在無基質(zhì)的條件下利用紫外激光直接解吸電離石墨板靶上食用油并獲得了TAGs的質(zhì)譜圖，但質(zhì)譜圖的信噪比和分辨率較差。Calvano等[19]研究發(fā)現(xiàn)無基質(zhì)激光解吸電離(LDI)的方式可直接用于橄欖油、大豆油、玉米油等多種食用油中的TAG成分研究。更深入的研究得知，利用LDI源可直接快速識別橄欖油中摻雜葵花籽油及快速甄別食用油的品質(zhì)[20]。此外，LDI源還被直接用于金屬有機化合物的直接分析，且可同時獲得元素和有機物的信息[21]。相比于MALDI源，LDI源的優(yōu)勢體現(xiàn)在可省去基質(zhì)結(jié)晶步驟，使樣品制備更加簡單且去除了基質(zhì)信號的干擾。雖然LDI源有以上優(yōu)勢，但利用LDI源對批量食用油的主成分分析卻少有報道。

本文利用LDI-FTICR-MS直接對食用油中的TAGs進行了快速分析研究，開發(fā)了一種更為簡便、快速分析食用油中TAGs的方法。根據(jù)TAGs的一級質(zhì)譜圖和二級碎片信息可以直接識別不同類型的食用油，利用主成分分析法和聚類分析法可快速地將批量的食用油進行歸類。此外，利用LDI源可直接識別橄欖油中的摻雜菜籽油且根據(jù)線性公式可以初步預測摻雜油品的種數(shù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與裝置

Solarix XR 7.0T FTICR-MS質(zhì)譜儀：美國Bruker公司產(chǎn)品，配有基質(zhì)輔助激光解吸電離源(MALDI)，DataAnalysis 4.4和ProfileAnalysis 2.2數(shù)據(jù)處理軟件，其中激光器為Smartbeam Ⅱ型的固態(tài)激光器，最大能量為300 μJ，頻率在0～1 kHz內(nèi)可調(diào)，波長為355 nm；WH-3微型旋渦混合儀：上海瀘西分析儀器有限公司。

1.2 材料與試劑

二氯甲烷(分析純，廣州市化學試劑廠)；三氟乙酸鈉校準溶液(NaTFA，美國Sigma-Aldrich公司)。橄欖油、大豆油、花生油、菜籽油、玉米油、葵花油等食用油購于本地超市；豬油自行制備。

1.3 樣品制備

食用油樣品：準確移取4 μL樣品分別溶于1 mL二氯甲烷后，利用渦旋儀混勻待測。

摻雜食用油1號：將菜籽油與橄欖油按體積比配制成系列混合食用油(0%、5%、10%、20%、40%、60%、80%、100%,V茶籽油∶V橄欖油)，然后準確移取4 μL樣品分別溶于1 mL二氯甲烷后，利用渦旋儀混勻待測。

摻雜食用油2號：將菜籽油和玉米油按體積比1∶1配制成混合油，進一步將混合油與橄欖油按體積比配制成系列混合食用油(10%、20%、30%、40%、50%、60%、80%，V混合油∶V橄欖油)，然后準確移取4 μL樣品分別溶于1 mL二氯甲烷中，利用渦旋儀混勻待測。

LDI點樣：移取1 μL制備好的食用油樣品點于樣品靶上即可進樣分析。

1.4 實驗條件

正離子模式下，選擇激光能量為45%，Medium模式光斑，100 Hz的激光頻率，輻照次數(shù)為100 shots，作用路徑為Random的條件進行實驗。設置質(zhì)量采集范圍m/z50～1 500，采樣大小為1 mega-words，累加次數(shù)為8，和諧阱累積時間為0.002 s進行數(shù)據(jù)采集。進行二級質(zhì)譜測定時，隔離窗口(Isolation window)設為10，碰撞能量為25 eV。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜實驗考察

與MALDI源不同，LDI離子源避免了基質(zhì)結(jié)晶好壞的影響，縮短了樣品制備時間。因此，實際質(zhì)譜圖質(zhì)量只受激光相關(guān)參數(shù)的影響，如激光光斑、激光能量、激光頻率等。當固定激光光斑大小時，增加激光能量和激光頻率會增強離子流且獲得高信噪比的質(zhì)譜圖。但對于FTICR-MS的質(zhì)量分析器來說，和諧阱的體積大小固定，若離子流太強，過剩的離子在質(zhì)量分析器中將受電荷排斥的影響而導致質(zhì)量軸偏移。為保證質(zhì)量軸精度，選擇光斑為Medium模式，45%激光能量，100 Hz的激光頻率，輻照次數(shù)為100 shots進行后續(xù)實驗。以5種不同品牌的玉米油為例進行了重復性驗證，多次測定質(zhì)譜圖中m/z877.73與m/z903.74的峰強度比，5種玉米油均可獲得良好的重現(xiàn)性，相對標準偏差RSD<10%。以上結(jié)果初步表明LDI-FTICR-MS可直接用于食用油中TAGs的分析。

2.2 大豆油與橄欖油一級譜圖分析

為保證質(zhì)量軸精度，實驗前均在ESI離子源模式下利用NaTFA標準溶液進行質(zhì)量軸校準。圖1A為采用LDI-FTICR-MS技術(shù)獲得的大豆油的歸一化一級質(zhì)譜圖，其中青色區(qū)域代表甘油二酯(Diacylglycerol,DAG)，粉色區(qū)域代表甘油三酯。由圖得知，甘油二酯與甘油三酯的比例與實際食用油中的比例相差較大。這是因為絕大多數(shù)甘油二酯由甘油三酯碎裂形成，所以在圖1A中將甘油二酯的區(qū)域標記為DAG like fragments。對譜圖作進一步解析得出圖1A中的青色區(qū)域主要為甘油二酯的離子峰(見圖1B)，并主要由含16個碳的棕櫚酸(P，C16H32O2)和含18個碳的油酸(O，C18H34O2)，亞油酸(L，C18H32O2)或亞麻酸(Ln，C18H30O2)兩兩組合而成。圖1C與圖1D分別為C52(C16∶C18∶C18)和C54(C18∶C18∶C18)甘油三酯的分布圖。由圖得知，除了獲得TAGs的鈉離子復合峰外，還可得到TAGs的鉀離子復合峰，且兩種復合峰的分布基本類似。而據(jù)報道，若使用MALDI源測定食用油中的甘油三酯時，其譜圖中主要以TAGs的鈉離子復合峰為主[22-23]。這是因為隨著LDI采用的激光能量的增加，制備樣品過程中溶劑中及樣品靶上殘留的鈉鹽和鉀鹽也易被解吸出來。另外，由于離子源在300 Pa的低真空環(huán)境中工作，離子源內(nèi)稀薄氣體中含有的微量鈉、鉀元素也會增加鈉、鉀離子復合峰的概率。因此，在高激光輻照條件下，LDI源很容易獲得TAGs鈉離子和鉀離子復合峰[24-25]。同理，橄欖油的一級歸一化質(zhì)譜圖也可以獲得相同的結(jié)果(圖2)。因此，由圖1和圖2初步得出，大豆油中亞油酸所占的比例最多，而橄欖油中油酸為主要成分。數(shù)據(jù)表明利用TAGs的一級質(zhì)譜圖可以區(qū)分不同類型的食用油。

2.3 多種食用油的特征譜圖分析

已有文獻報道利用MALDI源、APCI源可直接對不同種類食用油中的TAGs進行分析[23,26]，驗證了直接進樣分析方法具有高效、快速的優(yōu)勢。LDI離子源避免了基質(zhì)結(jié)晶的過程，因此具有分析更加快速、高效的特點。采用LDI源獲得的7種不同種類常用食用油中TAGs的分布見圖3，由圖得知，每種類型食用油的質(zhì)譜圖均含有TAGs的鈉離子和鉀離子的復合峰。對比圖3G與圖3A～F得知，豬油中因含有大量的不飽和脂肪酸(P，棕櫚酸)，所以質(zhì)譜圖中主要以C52的TAGs為主；植物油中富含不飽和脂肪酸，所以與動物油相比，植物油TAGs分布呈相反趨勢，主要以C54的TAGs為主。雖然葵花油、大豆油、玉米油等6種食用油的TAGs分布類似，但根據(jù)各自特異的TAGs分布也可進行區(qū)分。例如，根據(jù)m/z877.73與m/z903.74之間的比例即可區(qū)分葵花油和玉米油(見圖3A、D)。根據(jù)m/z877.73、m/z901.74及m/z903.74等可區(qū)分大豆油、葵花油與玉米油。

圖1 大豆油在不同質(zhì)量范圍內(nèi)的LDI-FTICR-MS質(zhì)譜圖Fig.1 Typical LDI mass spectra of soybean oil at various mass rangesmass ranges:A.m/z 300～1 000,B.m/z 560～620,C.m/z 870～900,D.m/z 890～930;P:palmitic acid，Ln:linolenic acid，L:linoleic acid，O:oleic acid

圖2 橄欖油的LDI-FTICR-MS質(zhì)譜圖Fig.2 Typical LDI mass spectra of soybean oil at various mass rangesmass range：A.m/z 300～1 000,B.m/z 560～620,C.m/z 870～900,D.m/z 890～930;P:palmitic acid,Ln:linolenic acid,L:linoleic acid,O:oleic acid,S:stearic acid

圖3 不同種類食用油的TAGs分布Fig.3 TAGs profile of different edible oils using LDI-FTICR-MSA:sunflower oil,B:soybean oil,C:peanut oil,D:corn oil,E:canola oil,F:olive oil,G:lard

圖4 典型的TAG碎裂路徑Fig.4 Typical the dissociation pathways for the [TAGs+Na]+

2.4 食用油二級譜圖分析

根據(jù)TAGs的一級質(zhì)譜圖分布可初步區(qū)分不同類型的食用油，若能獲取TAGs的二級碎片信息，將會為食用油中TAGs分析提供更加豐富、精確的信息。據(jù)文獻報道，當采用高能量的碰撞誘導解離(CID)方式進行TAGs碎片實驗研究時，碎片主要由TAGs失去1個脂肪酸或者脂肪酸鈉形成，具體的碎片離子形成機制可分為兩種，具體見圖4[27-28]。本實驗采用25 eV大小的碰撞能量分別對大豆油、橄欖油和豬油進行實驗，具體結(jié)果見圖5。當選擇圖5A中大豆油質(zhì)譜圖的m/z901.73作為母離子進行二級碎片實驗時，所得的碎片離子主要分為兩個區(qū)域，以m/z621.49和m/z599.50為主(圖5B)。其中，m/z621.49離子是由[LLL+Na]+失去1個L形成，即通過B-type斷裂方式形成[LL+Na]+；而m/z599.50離子則是[LLL+Na]+經(jīng)由C-type斷裂方式失去1個[L+Na]分子形成。通過這些碎片離子信息可以推測大豆油中含有大量亞油酸。當選擇橄欖油的m/z907.77進行二級碎片實驗時，TAGs會失去1個油酸或油酸鈉并形成以[OO+Na]+和[OO]+為主的兩種類型碎片峰，由此得知橄欖油中富含油酸分子(圖5C、D)，而通過豬油的二級碎片信息可推測豬油含有大量棕櫚酸，具體見圖5D和圖5F。獲得的TAGs碎片信息提供了更加精確的脂肪酸的組成，從而為精確定性食用油提供了更為豐富的信息。

圖5 甘油三酯的碎裂圖Fig.5 Mass spectra of TAG fragmentsA：soybean oil at m/z 901.73；B：expanded fragmentation information of soybean oil；C：olive oil at m/z 907.77；D：expanded fragmentation information of olive oil；E：lard at m/z 881.76；F：expanded fragmentation information of lard

2.5 統(tǒng)計學用于食用油的分析

雖然通過食用油中TAGs的一級質(zhì)譜和二級質(zhì)譜圖可以快速識別不同類型的食用油，但在實際的檢測分析中食用油種類繁雜，樣品量大，往往需要借助數(shù)據(jù)統(tǒng)計才能進行快速有效的篩查分析。常用的統(tǒng)計學主要包括主成分分析和聚類分析兩種[29-30]，主成分分析旨在用盡可能少的變量因子反映大量原始變量因子的主要信息，利用該方法可使復雜的數(shù)據(jù)簡單化。聚類分析是利用一組變量對目標進行分組歸類，樣本之間的相似性可以利用“距離”度量。距離越短，表明樣本的相似度越大。本實驗分別利用這兩種統(tǒng)計學對34種食用油進行分析。在分析前，需將m/z860～910質(zhì)荷比范圍內(nèi)的質(zhì)譜圖進行歸一化處理，其中主成分分析結(jié)果如圖6～7所示。由圖6得知，PC1和PC2的差異貢獻值分別為54.4%和77.0%。在置信度為95%的條件下，利用PCA分析法可將34種食用油明顯區(qū)分為7個區(qū)域(見圖7)，且根據(jù)分布可獲得每種食用油的特征質(zhì)荷比。另外，由圖8得知，聚類分析方法獲得的結(jié)果與主成分分析法的結(jié)果一致，能夠?qū)?4種食用油進行很好的歸類。統(tǒng)計學的數(shù)據(jù)表明，與MALDI源相似，LDI源同樣可快速區(qū)分不同種類食用油，該技術(shù)有望成為食用油的快速篩查和鑒定潛在的分析工具。

圖6 不同主成分的差異值Fig.6 Explained variance plot of a PCA model for 34 kinds of oils

圖8 34種食用油的聚類分析樹狀圖Fig.8 Hierarchical clustering analysis plot of 34 kinds of pure edible oils

2.6 橄欖油中菜籽油摻雜量

橄欖油因含有豐富的不飽和脂肪酸與具有美容養(yǎng)顏的功效而備受消費者青睞，但其價格卻高居不下。在緊俏的市場供應背景下，不法分子常在橄欖油中摻入一些低廉的食用油來牟取暴利。由于不同種類食用油中TAGs高度相似，常規(guī)的分析手段很難進行快速識別。為驗證LDI源對食用油快速準確的識別能力，在橄欖油中摻入了不同比例的菜籽油進行分析，以I881.76/I907.78與摻入菜籽油比例作圖，在0%～100%的比例范圍內(nèi)，可以獲得較好的線性(y=-0.003 87x+0.571 4，r2=0.981 2)，且即使摻雜5%的菜籽油也可以直接被快速識別。此外，將同等比例的菜籽油和玉米油的混合油(摻雜食用油2號)摻入橄欖油中，并同樣以I881.76/I907.78與摻入混合油的比例作圖，在10%～80%的比例范圍內(nèi)，仍然可以獲得良好的線性(y=-0.0024 4x+0.563 8，r2=0.989 4)。通過以上兩個線性公式可知，當摻入的食用油成分變化時會影響線性曲線的斜率但截距基本不變。因此，可以通過工作曲線斜率的變化初步推測橄欖油中摻雜的是一種食用油還是多種食用油。以上結(jié)果表明，LDI源具有快速識別摻雜食用油的能力。

3 結(jié) 論

本研究建立了一種用于食用油中TAGs分析的LDI-FTICR-MS直接快速分析方法。利用一級質(zhì)譜圖和二級碎片信息可以快速區(qū)分不同類型的食用油。利用統(tǒng)計學方法，可以有效地將34種食用油歸為7類。利用該方法可直接識別摻雜5%菜籽油的橄欖油。此外，根據(jù)線性曲線斜率可簡單推測橄欖油中摻雜的油是單個品種油還是混合油。結(jié)果表明，該方法可以簡便、快速可靠地分析食用油中的TAGs，有望成為快速篩查食用油的有效分析方法。

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