膠原水凝膠與基質(zhì)膠作為骨組織工程支架材料表面涂層修飾效果的比較研究▲

朱永佳 靳 攀 何 熠 繆志康 韋慶軍*

(1 廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院；2 廣西生物醫(yī)藥協(xié)同創(chuàng)新中心，南寧市 530021)

骨缺損是骨科手術(shù)的挑戰(zhàn)。骨替代物，支架的作用是創(chuàng)造細(xì)胞微環(huán)境進(jìn)而模擬體內(nèi)情況，并影響著增殖、分化和凋亡等細(xì)胞過(guò)程的必要條件。天然骨組織包括羥基磷灰石(HA)和膠原蛋白。目前膠原材料已引起人們的廣泛關(guān)注且用于骨組織工程。I型膠原蛋白具有良好的生物相容性，可作為大分子藥物緩慢釋放的載體[1-2]，其制作方法包括礦化[3]、熱觸發(fā)組裝[4]、真空滲透[5]、凍干及超臨界點(diǎn)干燥[6]?；|(zhì)膠，是一種基底膜提取物，被廣泛應(yīng)用于腫瘤轉(zhuǎn)移的研究中[7]，其表面涂層可用于提高支架的成骨活性等生物學(xué)功能[8-9]，但目前針對(duì)這兩種材料的比較研究尚未有報(bào)道。

本研究通過(guò)堿性磷酸酶檢測(cè)、組織學(xué)染色以及RT-PCR檢測(cè)成骨特異性基因的表達(dá)水平比較膠原水凝膠及基質(zhì)膠的效果，以此來(lái)尋找更合適的骨組織工程支架涂層修飾材料。現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 原代成骨細(xì)胞的分離提取 3～7 d日齡SD乳鼠購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，且后續(xù)操作均獲得廣西醫(yī)科大學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。用頸椎脫臼法處死SD乳鼠，無(wú)菌環(huán)境下用滅菌紗布取出頂骨，浸于滅菌磷酸鹽緩沖液(PBS)中，然后用0.25%胰蛋白酶-乙二胺四乙酸(EDTA)(北京索萊寶生物技術(shù)有限公司)在37℃消化30 min除去結(jié)締組織及骨膜。將頂骨剪成1 mm3的碎片后，用Ⅰ型膠原酶(Gibco，Thermo Fisher Scientific，Inc.，Waltham，MA，USA)37℃下孵育4 h。800 g離心5 min后，將細(xì)胞重懸于含有10%(v/v)胎牛血清(FBS，Gibco)和1%青霉素/鏈霉素溶液(青霉素100 U/mL，鏈霉素100 U/mL)的培養(yǎng)基中，置于37℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，選擇第3代細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 水凝膠制備和細(xì)胞接種 膠原水凝膠儲(chǔ)備液呈酸性，不利于細(xì)胞生長(zhǎng)。為了獲得適宜細(xì)胞生長(zhǎng)的水溶液，將氫氧化鈉溶液逐滴滴入酸性的膠原水凝膠儲(chǔ)備液中至pH 7.0。基質(zhì)膠(Becton Dickinson，USA)在4℃環(huán)境下融化至液態(tài)。在24孔板中加入20 μL凝膠及在6孔板中加入100 μL凝膠，均勻覆蓋于底部，待固化后，在24孔板及6孔板分別接種2×104細(xì)胞及5×104細(xì)胞培養(yǎng)。

1.3 細(xì)胞活性檢測(cè) 細(xì)胞活性通過(guò)熒光素二乙酯(FDA，Genway Biotech Inc，USA)/碘化丙啶(PI，Sigma，USA)染色檢測(cè)。用PBS洗滌3次后，將細(xì)胞與2 μM FDA和2 mg/L PI室溫避光環(huán)境中分別溫育5 min，后通過(guò)激光掃描共聚焦顯微鏡(LSCM， Nikon A1， Japan)拍攝圖像。

1.4 細(xì)胞形態(tài)分析 培養(yǎng)2、4、6 d后，經(jīng)多聚甲醛固定30 min，并依次用蘇木精-伊紅(HE，南京建成生物技術(shù)有限公司)進(jìn)行細(xì)胞染色。最后用中性樹(shù)膠密封，用倒置相差顯微鏡觀察并拍照。

1.5 ALP染色和ALP活性測(cè)定 按說(shuō)明書(shū)分別用ALP染色試劑盒和ALP檢測(cè)試劑盒(均購(gòu)自南京建成生物工程研究所)進(jìn)行2、4、6 d堿性磷酸酶(ALP)染色和ALP細(xì)胞活性測(cè)定，觀察染色情況并用倒置相差顯微鏡拍攝圖像。同時(shí)，用不含蛋白酶抑制劑(1 mM)的細(xì)胞裂解液(RAPI)提取每個(gè)樣品的總蛋白，在12 000 rpm離心15 min后，收集培養(yǎng)基的上清液用于檢測(cè)。加入試劑標(biāo)準(zhǔn)液、顯色劑水浴和著色后，用酶標(biāo)儀在520 nm處檢測(cè)吸光度值，隨后將值換算成金氏單位，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 茜素紅染色 培養(yǎng)2、4、6 d后，用PBS洗滌細(xì)胞，用4%多聚甲醛(PFA)固定30 min，并在37℃用1 mL 0.1%茜素紅S(Sigma，USA，pH8.3)持續(xù)染色30 min。隨后，用流水輕輕去除過(guò)量染料，用倒置相差顯微鏡進(jìn)行圖像拍攝。

1.7 免疫組化檢測(cè) 將細(xì)胞用4%多聚甲醛固定30 min，加入3% H2O230 min以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，與山羊血清在37℃溫育30 min以阻斷非特異性結(jié)合。用Ⅰ型膠原(1 ∶100，Boster，武漢)抗體在4℃孵育過(guò)夜后，加入Cy3-抗-兔IgG二抗(1 ∶100，Boster，武漢)。用DAB孵育并用蘇木精復(fù)染后，將細(xì)胞風(fēng)干，中性樹(shù)脂密封，并用倒置相差顯微鏡拍照。

1.8 RNA的提取和qRT-PCR檢測(cè) 用qRT-PCR檢測(cè)骨形態(tài)發(fā)生蛋白2(Bmp2)、runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runx2)、堿性磷酸酶(Alp)、骨鈣素(Ocn)、骨橋蛋白(Opn)和1型膠原蛋白(Col1a1)的表達(dá)。使用RNA提取試劑盒(Megentec，廣州)提取總RNA。從1 μg RNA開(kāi)始，使用Fast Start Universal SYBR Green Master Mix(Invitrogen，CA，USA)擴(kuò)增的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Fermentas Company，USA)合成20 μg cDNA。本實(shí)驗(yàn)中使用的引物見(jiàn)表1。通過(guò)使用比較2-ΔΔCt方法將基因表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化為Gapdh。每個(gè)樣品重復(fù)3次以減少標(biāo)準(zhǔn)差。

表1 PCR引物序列表

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，組間比較使用單因素方差分析(ANOVA)和最小顯著差異(LSD)進(jìn)行分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞活性檢測(cè) 通過(guò)FDA/PI染色測(cè)定細(xì)胞活性。如圖1所示，活細(xì)胞染成綠色，死細(xì)胞染成紅色。與對(duì)照組相比，膠原組和基質(zhì)膠組中發(fā)現(xiàn)更多活的成骨細(xì)胞，其中膠原組活細(xì)胞數(shù)量明顯高于基質(zhì)膠組，說(shuō)明膠原對(duì)成骨細(xì)胞活性具有積極作用。

圖1 空白組、基質(zhì)膠組及膠原組的FDA/PI染色(活細(xì)胞顯示綠色，死細(xì)胞顯示紅色，200×)

2.2 細(xì)胞形態(tài)分析 HE染色觀察三組成骨細(xì)胞的形態(tài)(圖2)。細(xì)胞質(zhì)染成紅色，細(xì)胞核染成藍(lán)色。隨時(shí)間增加，各組成骨細(xì)胞數(shù)目增多，其中膠原組細(xì)胞形態(tài)與數(shù)目均優(yōu)于其他組。

圖2 空白組、基質(zhì)膠組及膠原組的HE染色(200×)

2.3 ALP染色和ALP活性測(cè)定 作為骨形成的標(biāo)志物，ALP與成骨分化有關(guān)。所有組中ALP染色程度均隨時(shí)間增加(見(jiàn)圖3)，其中膠原組ALP染色程度明顯高于其他兩組。ALP活性從第2天至第6天持續(xù)增加，在膠原組中更為明顯(見(jiàn)圖4)。ALP定性及定量結(jié)果分析均表明膠原水凝膠更適合成骨細(xì)胞的生長(zhǎng)。

圖3 空白組、基質(zhì)膠組及膠原組的堿性磷酸酶染色(200×)

圖4 空白組、基質(zhì)膠組及膠原組成骨細(xì)胞內(nèi)堿性磷酸酶活性檢測(cè)(*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001)

2.4 茜素紅染色 使用茜素紅染色來(lái)評(píng)估成骨細(xì)胞的礦化結(jié)節(jié)，基質(zhì)膠組和膠原組在第2天及第4天沒(méi)有發(fā)現(xiàn)明顯差異。然而，在第6天，與對(duì)照組和基質(zhì)膠組相比，膠原組明顯增強(qiáng)了礦化作用，其產(chǎn)生了更多的礦化結(jié)節(jié)(見(jiàn)圖5)。

圖5 空白組、基質(zhì)膠組及膠原組的茜素紅染色(200×)

2.5 免疫組化檢查 Ⅰ型膠原蛋白被認(rèn)為是骨形成中特異性的蛋白，本研究用免疫組織化學(xué)方法評(píng)估Ⅰ型膠原蛋白。結(jié)果顯示，膠原組比其他組呈現(xiàn)更明顯的陽(yáng)性結(jié)果；同時(shí)，基質(zhì)膠組中的陽(yáng)性表達(dá)高于對(duì)照組(見(jiàn)圖6)。

圖6 空白組、基質(zhì)膠組及膠原組的Ⅰ型膠原免疫組化染色(200×)

2.6 基因表達(dá)分析 成骨特異性基因Alp、Ocn和Col1a1在膠原蛋白組中明顯上調(diào)(見(jiàn)圖7)，表明膠原有利于成骨；膠原組中隨時(shí)間增加Col1a1的mRNA水平表明膠原可以通過(guò)外源性添加觸發(fā)內(nèi)源基因編碼程序。

圖7 Bmp2、Runx2、Alp、Ocn、Opn和Col1a1的相對(duì)表達(dá)情況(*代表P<0.05，**代表P<0.01， ***代表P<0.001)

3 討 論

膠原水凝膠及基質(zhì)膠均具有良好的生物相容性和極低的細(xì)胞毒性，有助于創(chuàng)造一個(gè)復(fù)雜的模擬體內(nèi)的細(xì)胞微環(huán)境，它們被推薦作為表層細(xì)胞支架涂層修飾使用[7]。然而，目前還沒(méi)有研究比較它們對(duì)細(xì)胞成骨分化的影響。

如圖1所示，隨著時(shí)間的推移，成骨細(xì)胞在膠原涂層比在基質(zhì)膠涂層數(shù)量增加更顯著，demon闡述了膠原涂層在細(xì)胞生存方面比基質(zhì)膠涂層更有優(yōu)勢(shì)[10]。與FDA/PI染色一致，更多的細(xì)胞聚集在膠原涂層上，尤其是第4～6天(圖2)。由成骨細(xì)胞產(chǎn)生并參與到無(wú)機(jī)焦磷酸鹽的降解過(guò)程中，為礦化的發(fā)生提供足夠的磷酸鹽或無(wú)機(jī)焦磷酸鹽，ALP通常作為骨生成的標(biāo)記來(lái)反映成骨分化的程度[11-12]。圖3中的ALP染色和圖4中的ALP活性分析都表明在膠原組中有更多的ALP分泌，這與圖7中Alp的mRNA水平一致。圖5顯示第 6天的茜素紅染色礦化結(jié)節(jié)，證實(shí)了這兩種涂層方法的成骨效應(yīng)。Ⅰ型膠原作為細(xì)胞外基質(zhì)的主要有機(jī)象，促進(jìn)了細(xì)胞的附著、增殖和分化[13-14]。在圖6中，利用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)到的Ⅰ型膠原蛋白水平，與圖7的基因表達(dá)相一致。骨鈣素(Ocn)和骨橋蛋白(Opn)都是成骨分化的特征性標(biāo)志物。Ocn是一種由成骨細(xì)胞分泌的特異性蛋白，是骨細(xì)胞分化良好的標(biāo)志[15]。Opn被認(rèn)為是細(xì)胞粘附因子，其分泌主要在骨形成過(guò)程的早期階段[16]。圖7所示，Ocn從第2天到第6天持續(xù)增加，而Opn在第2天達(dá)到峰值，與前期研究一致[15]。BMP-2信號(hào)通路是調(diào)節(jié)骨再生的主要通路之一[17]，并通過(guò)BMP/Smad信號(hào)通路調(diào)節(jié)Runx2的表達(dá)和功能[18-20]。本研究中，膠原組Bmp2和Runx2在第2天顯著上調(diào)了，并在第4天到第6天保持相對(duì)穩(wěn)定的水平。實(shí)驗(yàn)中檢測(cè)的基因表達(dá)表明了膠原涂層能夠促進(jìn)骨細(xì)胞分化，膠原蛋白的外源性增生可以引發(fā)和誘導(dǎo)基因編碼程序和膠原蛋白的內(nèi)源性分泌。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，與基質(zhì)膠涂層比較，膠原水凝膠涂層更有利于骨形成且更適合在骨組織工程中作為細(xì)胞支架表面修飾材料，推薦其作為骨組織工程支架材料常用表面涂層材料。

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