wnt5a誘導(dǎo)心肌祖細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的作用研究

吳良宇，向平，劉玲娟，何通川，房松華，呂鐵偉，田杰，李謐

心力衰竭是小兒心血管疾病中由多種因素引發(fā)的一組心功能受損的嚴(yán)重綜合征，是兒童致死的常見原因之一[1]。目前，傳統(tǒng)藥物治療只能在一定程度上保護(hù)心肌、延緩心臟疾病的進(jìn)程，卻無法使功能性心肌細(xì)胞再生，難以從根本上逆轉(zhuǎn)慢性心衰的發(fā)展進(jìn)程[2]。心臟移植是治療心衰的最終方法，但因供體受限、術(shù)后長期免疫抑制、免疫排斥等原因，很難在臨床上大規(guī)模推廣[3-4]。細(xì)胞移植修復(fù)受損心肌具有誘人的前景[5]。近十余年，國內(nèi)外學(xué)者在通過Wnt信號通路誘導(dǎo)干細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化做了大量的研究，并取得了肯定的效果。wnt5a是非經(jīng)典Wnt信號通路的代表配體。研究發(fā)現(xiàn)，wnt5a表達(dá)上調(diào)可通過激活Notch信號促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化[6]，wnt5a也能夠通過激活蛋白激酶C δ(PKC δ)從而增加人類循環(huán)前體細(xì)胞的心臟基因表達(dá)[7]，由此可見，wnt5a在心肌細(xì)胞分化和心臟形成過程中具有重要作用。然而，wnt5a在心肌祖細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化成熟及其在心肌受損修復(fù)中的作用仍有待進(jìn)一步研究。本研究旨在探討非經(jīng)典Wnt信號途徑中的wnt5a對心肌祖細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化的作用。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑 心肌祖細(xì)胞CP15-5a、wnt5a重組腺病毒、綠色熒光蛋白(GFP)重組腺病毒、HEK293細(xì)胞均來自美國芝加哥大學(xué)分子腫瘤實驗室。DMEM高糖培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基及優(yōu)質(zhì)胎牛血清FBS購自美國Gibco公司，全蛋白提取試劑盒、Western blotting配膠試劑盒和Super ECL檢測液購自中國凱基公司，RNA提取試劑盒、Real-time PCR試劑盒和反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，鼠抗β-actin單克隆抗體購自中國鐘鼎生物公司，兔抗鼠CX43單克隆抗體購自美國Cell signaling公司，鼠單抗cTnT單克隆抗體購自英國Abcam公司，HRP標(biāo)記羊抗兔二抗和HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗購自中國中杉生物公司，Dylight 488抗山羊二抗購自中國Abbkine公司，0.22μm PVDF膜購自美國Millipore公司，一抗二抗洗脫液購自中國碧云天公司。

1.2 方法

1.2.1 HEK293細(xì)胞和CP15-5a細(xì)胞培養(yǎng) 取HEK293細(xì)胞和CP15-5a細(xì)胞快速復(fù)溫移至含5ml DMEM高糖培養(yǎng)基的離心管中，1000r/min離心5min，用培養(yǎng)基重懸至培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)。待細(xì)胞長至培養(yǎng)瓶壁約75%時用PBS洗3次，胰酶消化、1000r/min離心5min，按1:3傳代繼續(xù)培養(yǎng)。

1.2.2 wnt5a重組腺病毒和GFP重組腺病毒的擴(kuò)增當(dāng)培養(yǎng)的HEK293細(xì)胞融合至75%時加入1μl病毒原液，培養(yǎng)3d左右，待大部分細(xì)胞變圓脫落，用槍頭吹下未脫落細(xì)胞，1000r/min離心5min，得到病毒細(xì)胞沉淀進(jìn)行冷凍、融化，劇烈振蕩，重復(fù)4次后，4℃、14 000r/min離心15min，取上清即為病毒液。多次重復(fù)以上步驟直至得到適當(dāng)?shù)母叩味认俨《?。采用GFP熒光標(biāo)記法，分別按10–2~10–6梯度稀釋擴(kuò)增的腺病毒，取對數(shù)生長期HEK293細(xì)胞，計數(shù)，鋪24孔板，每孔500μl(5×105細(xì)胞/ml)。每個病毒梯度設(shè)3個復(fù)孔，每孔滴加50μl待測病毒樣品，培養(yǎng)48h。直接熒光顯微鏡下計數(shù)每視野熒光細(xì)胞數(shù)。視野下每個熒光細(xì)胞視為一個熒光單位，病毒滴度以綠色熒光形成單位/ml(GFU/ml)表示要。綠色熒光蛋白形成單位/ml(GFU/ml)=[(綠色熒光細(xì)胞數(shù)/視野)×(視野/孔)]/[病毒體積(ml)×稀釋系數(shù)]。

1.2.3 Adwnt5a和AdGFP轉(zhuǎn)染CP15-5a細(xì)胞 計數(shù)CP15-5a細(xì)胞，取5×105個細(xì)胞鋪于T25培養(yǎng)瓶中，設(shè)置為3個組，分別是wnt5a組(wnt5a腺病毒轉(zhuǎn)染)、GFP組(GFP腺病毒轉(zhuǎn)染)和空白對照組(未轉(zhuǎn)染)。第2天棄培養(yǎng)基，加入新鮮無血清培養(yǎng)基，wnt5a組和GFP組分別加入4.71μl的wnt5a腺病毒和3.08μl的GFP腺病毒，放入孵箱繼續(xù)培養(yǎng)12h再次換液，24h后觀察兩組細(xì)胞GFP的表達(dá)及細(xì)胞生長情況。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測腺病毒對CP15-5a細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率 腺病毒轉(zhuǎn)染細(xì)胞24h后，取1×106個Adwnt5a轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為實驗組，同時取1×106個CP15-5a細(xì)胞作為陰性對照組，將細(xì)胞消化、離心，用PBS洗2次，200μl PBS重懸至EP管中，在488nm紫外光激發(fā)下計數(shù)GFP陽性細(xì)胞比率。

1.2.5 qRT-PCR 腺病毒轉(zhuǎn)染CP15-5a細(xì)胞1周后，用RNA提取試劑盒提取分別提取wnt5a組、GFP組和空白對照組細(xì)胞的RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以cDNA為模板，β-actin為內(nèi)參檢測GATA4、MEF2C的mRNA表達(dá)量。數(shù)據(jù)分析采用比較Ct法(ΔΔCt)，數(shù)據(jù)取3次重復(fù)的平均值，所用引物見表1。

1.2.6 Western blotting檢測CX43、cTnT的表達(dá) 腺病毒轉(zhuǎn)染CP15-5a細(xì)胞2周后，按照凱基全蛋白提取試劑盒說明書分別提取wnt5a組、GFP組和空白對照組細(xì)胞的全蛋白，BCA法檢測蛋白濃度，配膠，按濃度加樣電泳，半干轉(zhuǎn)膜、封閉，孵育一抗14h(兔單抗CX43按1:1000稀釋，鼠單抗cTnT按1:10 000稀釋)，TBST洗膜30min，孵育二抗1h(羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗稀釋比例均為1:10 000)，TBST洗膜30min，配制ECL顯影液曝光顯影。數(shù)據(jù)取3次重復(fù)的平均值。

表1 PCR引物序列[8]Tab.1 Primer sequence used for PCR assay[8]

1.2.7 免疫熒光技術(shù)檢測CX43的表達(dá) CP15-5a細(xì)胞鋪板，wnt5a病毒組和GFP病毒組細(xì)胞分別處理2周，漂洗；多聚甲醛固定，漂洗；TritonX-100破膜，漂洗；山羊血清封閉，孵育一抗兔單抗CX43按1:100過夜，漂洗；孵育二抗，漂洗，DAPI染色，封片，熒光顯微鏡下觀察結(jié)果。

1.2.8 全細(xì)胞膜片鉗技術(shù) wnt5a病毒組和GFP病毒組細(xì)胞分別處理2周，對3組細(xì)胞進(jìn)行爬片處理6h，細(xì)胞開始貼壁且呈圓形時開始實驗。在時程300ms的去極化脈沖下保持電位–80mV，以10mV間距給予幅值為–120~+50mV的鉗制電壓。應(yīng)用Clampex程序采樣，采樣頻率為10kHz，濾波頻率2kHz，記錄不同鉗制電壓下的膜電流。采用Axon-patch700B膜片鉗放大器記錄電流，經(jīng)過Digidatal320A轉(zhuǎn)化器和pclamp9.2分析軟件系統(tǒng)采集數(shù)據(jù)，記錄在細(xì)胞外液中加入鈉通道阻滯劑河豚毒素(TTX)前后的鈉電流(INa)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量數(shù)據(jù)以表示，多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較方差齊采用LSD-t檢驗，方差不齊采用Dunnett's T3檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 重組腺病毒擴(kuò)增結(jié)果 腺病毒加入HEK293細(xì)胞48h后，熒光顯微鏡觀察可見大部分HEK293細(xì)胞出現(xiàn)變亮、變圓、飄落。GFP熒光標(biāo)記法測得wnt5a腺病毒滴度為1.7×1010GFU/ml，GFP腺病毒滴度為2.6×1010GFU/ml。

2.2 Ad-wnt5a和Ad-GFP感染的CP15-5a細(xì)胞形態(tài)改變 Ad-wnt5a和Ad-GFP分別感染CP15-5a細(xì)胞24h后，繼續(xù)培養(yǎng)2周，在倒置相差顯微鏡下wnt5a組細(xì)胞排列緊密有序且細(xì)胞呈長梭形，GFP組細(xì)胞排列混亂無方向性。在熒光顯微鏡下觀察可見兩者均有大量綠色熒光(圖1)。

圖1 CP15-5a細(xì)胞倒置相差顯微鏡和熒光顯微鏡觀察(×100)Fig.1 Contrast diagram of inverted phase contrast microscope and fluorescence microscope for CP15-5a cells (×100)

2.3 流式細(xì)胞儀檢測的病毒轉(zhuǎn)染效率 Ad-wnt5a和Ad-GFP轉(zhuǎn)染CP15-5a細(xì)胞24h后，檢測轉(zhuǎn)染效率分別為42.8%、44.3%。

2.4 各組GATA4、MEF2C的表達(dá)情況 qRTPCR檢測結(jié)果顯示，wnt5a組中GATA4基因的表達(dá)量(1.717±0.220)明顯高于GFP組和空白對照組(1.003±0.087、0.961±0.063)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而GFP組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義；wnt5a組中MEF2C基因的表達(dá)量(1.847±0.190)明顯高于GFP組和空白對照組(0.456±0.042、0.500±0.095)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，而GFP組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖2)。

2.5 各組CX43、cTnT蛋白的表達(dá)情況 Western blotting檢測結(jié)果顯示，wnt5a組CX43、cTnT蛋白的表達(dá)(分別為1.597±0.267、0.727±0.100)明顯高于GFP組和空白對照組(CX43：0.723±0.047、0.783±0.1333；cTnT：0.217±0.021和0.253±0.102)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，而GFP組與空白對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(圖3)。

2.6 免疫熒光技術(shù)檢測CX43的細(xì)胞內(nèi)定位 wnt5a組CX43在細(xì)胞質(zhì)中有明顯表達(dá)，而GFP組CX43在細(xì)胞質(zhì)中未見明顯表達(dá)(圖4)。

圖2 qRT-PCR檢測GATA4、MEF2C的表達(dá)Fig.2 mRNA expression of GATA4 and MEF2C by qRT-PCR

圖3 各組CX43、cTnT的蛋白表達(dá)(Western blotting)Fig.3 CX43 and cTnT protein levels in each group (Western blotting)

2.7 全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測INa經(jīng)腺病毒誘導(dǎo)后，3組細(xì)胞中僅wnt5a組可以檢測出INa，且具有一定時間依賴性，INa在–70mV左右開始激活，在–10mV左右時達(dá)到最大，在達(dá)到+30mV左右時開始消失(圖5A)。在細(xì)胞外液加入鈉通道阻滯劑TTX 5min后電流明顯減弱(圖5B)。圖5C為根據(jù)在300ms內(nèi)不同鉗制電壓下測得的各電流峰值均值繪制的I-V曲線。GFP組和空白對照組均未見特異性INa。

圖4 免疫熒光技術(shù)檢測CX43的細(xì)胞內(nèi)定位(×200)Fig.4 Intracellular localization of CX43 (Immunofluorescent technique ×200)

3 討 論

干細(xì)胞移植治療心臟疾病是近年的研究熱點(diǎn)。隨著臨床病例數(shù)的增多，細(xì)胞移植成分逐漸向組成單一、純度高的組織定向干細(xì)胞群過渡。但是外源性干細(xì)胞移植成分復(fù)雜，它們在心肌微環(huán)境的誘導(dǎo)下可表現(xiàn)出向心肌樣細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞等分化的多向性，并由此帶來微梗死、心律失常、腫瘤等一系列的移植并發(fā)癥[9-10]。相對于其他外源性干細(xì)胞，心肌祖細(xì)胞屬于成體干細(xì)胞，能誘導(dǎo)分化為心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞[11]，采用心肌祖細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞移植可能會減少上述移植并發(fā)癥的發(fā)生。此外，心肌損傷后與胚胎發(fā)育的心肌微環(huán)境不同，原始狀態(tài)的干細(xì)胞在成熟心肌環(huán)境中不能被正常調(diào)控，移植后只有少數(shù)細(xì)胞停留在心臟歸巢現(xiàn)象[12]，而心肌祖細(xì)胞是心臟來源的干細(xì)胞，在心臟微環(huán)境中有較好的適應(yīng)性，可能更適合移植后的細(xì)胞歸巢。在成體心臟受損時，心肌祖細(xì)胞會動員修復(fù)受損心肌，但是其代償修復(fù)功能有限[13]。原始的心肌祖細(xì)胞增殖周期有限，用于細(xì)胞體內(nèi)外的研究有很大的局限性。本課題組前期成功建立了心肌祖細(xì)胞株[14]，為誘導(dǎo)心肌祖細(xì)胞向心肌細(xì)胞分化提供了實驗基礎(chǔ)。

圖5 全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)檢測CP15-5a細(xì)胞的INaFig.5 INa in CP15-5a cells (Whole-cell patch clamp technique)

GATA4和MEF2C是心臟早期發(fā)育的重要因子[15-16]。本實驗通過上調(diào)wnt5a培養(yǎng)心肌祖細(xì)胞1周后，qRTPCR檢測GATA4和MEF2C的表達(dá)明顯增高，從基因?qū)用娉浞肿C明了wnt5a的作用。CX43和cTnT是心肌的特異性蛋白，尤其是cTnT，在心肌中具有高度的特異性[17]，一般只在心肌細(xì)胞中表達(dá)，可作為鑒定心肌分化的指標(biāo)。上調(diào)wnt5a干預(yù)心肌祖細(xì)胞培養(yǎng)2周后，本研究結(jié)果顯示實驗組心肌特異性蛋白cTnT、CX43表達(dá)量較對照組明顯增高，提示上調(diào)wnt5a干預(yù)心肌祖細(xì)胞可促進(jìn)其分化為心肌細(xì)胞。此外CP15-5a細(xì)胞要成為成熟的心肌細(xì)胞，必須具備同步的自主收縮功能，這除了需要心肌特異性的收縮蛋白以外，心肌特異性的電生理功能也必不可少。本實驗在wnt5a腺病毒感染CP15-5a細(xì)胞2周后可以檢測到INa的發(fā)生。INa是心臟發(fā)育過程的重要因子[18]，作為心肌細(xì)胞興奮或去極化的第一個離子流，其變化對興奮的發(fā)生及傳導(dǎo)均有重要意義，且在房室樣細(xì)胞的分化晚期可以充分表達(dá)。而INa的出現(xiàn)進(jìn)一步說明經(jīng)wnt5a感染后的CP15-5a細(xì)胞在電生理上較空白對照組和GFP組細(xì)胞更為成熟和完善。以上實驗結(jié)果可以有力地證明wnt5a誘導(dǎo)后的CP15-5a細(xì)胞在電生理特性上較空白對照組和GFP組細(xì)胞與心肌細(xì)胞更為相似，更有可能成功分化為成熟的心肌細(xì)胞。此外，與空白對照組和GFP組細(xì)胞相比，wnt5a組CP15-5a細(xì)胞與正常成熟的心肌細(xì)胞有著更好的同質(zhì)性。

Wnt5a是Wnt蛋白家族的成員之一，是非經(jīng)典Wnt信號途徑的代表，在細(xì)胞成熟、胚胎發(fā)育等過程中發(fā)揮著重要作用[19-21]。Wnt5a信號在干細(xì)胞自我更新、分化及心臟發(fā)生中有著重要的調(diào)控作用，可通過激活非經(jīng)典Wnt信號通路上調(diào)wnt5a的表達(dá)，誘導(dǎo)帶有Sca1+/c-kit+的鼠脂肪源性血管基質(zhì)細(xì)胞分化為自發(fā)搏動的心肌細(xì)胞[22]。本實驗采用wnt5a誘導(dǎo)心肌祖細(xì)胞成功分化為了心肌細(xì)胞。此外，本實驗通過重組腺病毒穩(wěn)定高效地轉(zhuǎn)染心肌祖細(xì)胞，wnt5a基因在細(xì)胞中得到穩(wěn)定表達(dá)。重組腺病毒具有對宿主細(xì)胞致病率低，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染和表達(dá)目的基因，無致突變性，并可通過HEK293細(xì)胞擴(kuò)增出理想的高滴度病毒，以及較為經(jīng)濟(jì)等多個優(yōu)點(diǎn)[23]。

綜上所述，本研究在體外通過Ad-wnt5a成功誘導(dǎo)了心肌祖細(xì)胞向心肌細(xì)胞的分化，從而為進(jìn)一步的體內(nèi)細(xì)胞移植修復(fù)受損心肌奠定了實驗基礎(chǔ)。后續(xù)將進(jìn)行體內(nèi)實驗驗證心肌祖細(xì)胞移植的效果和并發(fā)癥發(fā)生情況。

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