羅哌卡因乳酸-蓖麻油共聚物微球在小鼠坐骨神經(jīng)旁的緩釋作用研究

王博，趙峰，公茂偉，段明達(dá)，霍修林，龔潔，傅強(qiáng)

有效控制術(shù)后疼痛可以提高患者的滿意度和舒適度，加速患者康復(fù)，減少慢性疼痛綜合征的發(fā)生。阿片類藥物曾廣泛用于術(shù)后疼痛的治療，但惡心、嘔吐、呼吸抑制等副作用限制了其臨床使用[1]。隨著神經(jīng)阻滯技術(shù)的推廣和應(yīng)用，局部麻醉藥物的應(yīng)用越來越廣泛[2-3]，局部注射局麻藥進(jìn)行圍術(shù)期鎮(zhèn)痛也受到了醫(yī)生和患者的青睞。盡管局麻藥可有效減輕患者的疼痛，但臨床常用的局麻藥作用時間較短，不能有效長時間地鎮(zhèn)痛[4-5]，需要間斷注射或通過植入導(dǎo)管持續(xù)泵入給藥[6]，不僅需要相應(yīng)的設(shè)備，增加了患者的醫(yī)療負(fù)擔(dān)，同時留置的導(dǎo)管容易移位、脫出或引起感染[7]。

隨著藥物緩釋技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外學(xué)者對局麻藥緩釋給藥系統(tǒng)進(jìn)行了研究，如水凝膠、脂質(zhì)囊、微球技術(shù)等[8]。微型成球技術(shù)利用天然的或合成的高分子聚合物作為控制藥物釋放的載體，可使藥物緩慢釋放，延長藥物的作用時間。該技術(shù)的應(yīng)用不僅延長了局部單次給藥后的鎮(zhèn)痛時間，減少了給藥次數(shù)，同時也降低了局麻藥物血藥濃度的波動及其毒性反應(yīng)。本研究以生物降解聚合物乳酸-蓖麻油作為載體材料，鹽酸羅哌卡因為包裹藥物，采用雙重乳化-溶劑揮發(fā)法合成一種緩釋制劑羅哌卡因乳酸-蓖麻油共聚物微球，將其植入小鼠坐骨神經(jīng)旁，通過小鼠感覺運(yùn)動阻滯時效和體內(nèi)血藥濃度來評估其緩釋作用效果，現(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器 羅哌卡因?qū)φ掌?中國藥品生物制品檢定所)；乳酸-蓖麻油共聚物(實驗室自制)；氫氧化鈉、氯仿等試劑均為市售化學(xué)純或分析純。ZH-YLS-6B智能熱板儀(安徽正華生物儀器設(shè)備有限公司)；LC-1260高效液相色譜儀(安捷倫科技有限公司)；FJ200-S數(shù)顯高速均質(zhì)機(jī)(上海標(biāo)本模型廠)；DF-Ⅱ型恒溫磁力攪拌器(金壇市杰瑞爾電器有限公司)。

1.2 藥物的制備 采用雙重乳化-溶劑揮發(fā)法制備乳酸-蓖麻油共聚物微球。精密稱取一定量的羅哌卡因，用蒸餾水溶解作為內(nèi)水相；另取適量乳酸-蓖麻油共聚物和乳化劑溶于二氯甲烷作為有機(jī)相。將兩相混合，采用高速分散均質(zhì)機(jī)均質(zhì)90s，制成初乳。將初乳移入外水相聚乙烯醇水溶液中，用高速分散均質(zhì)機(jī)均質(zhì)90s，制得復(fù)乳。將復(fù)乳在磁力攪拌器上攪拌2h后離心、過濾，用超純水洗滌3次，收集微球，真空冷凍干燥24h后，–4℃儲藏備用。對照組不加羅哌卡因，同種方法制備成不含藥的乳酸-蓖麻油共聚物空白微球。

1.3 實驗動物篩選 取體重20~25g的雄性昆明小鼠，置于50℃ ZH-YLS-6B智能熱板上，以小鼠舔后足反應(yīng)的潛伏期為痛閾指標(biāo)，每只小鼠測定3次，每次間隔5min，取3次測定結(jié)果的平均值作為基礎(chǔ)痛閾。將反應(yīng)潛伏期小于5s或大于30s的小鼠剔除，并保證小鼠雙側(cè)下肢感覺運(yùn)動無明顯差異。

1.4 動物分組及給藥 將篩選后符合標(biāo)準(zhǔn)的150只雄性昆明小鼠隨機(jī)分為3組：空白微球?qū)φ战M(A組，n=50)、羅哌卡因組(B組，n=50)、羅哌卡因乳酸-蓖麻油共聚物微球組(C組，n=50)。小鼠經(jīng)2%七氟醚吸入麻醉后俯臥位固定于手術(shù)臺上，剔除臀部鼠毛，切開皮膚和皮下組織，鈍性分離暴露雙下肢坐骨神經(jīng)，在其周圍均勻包埋微球或注入鹽酸羅哌卡因(0.2ml，0.5%)建立動物模型。

1.5 小鼠坐骨神經(jīng)感覺阻滯評估 每組分別在給藥后10min、30min、1h、3h、5h、7h、10h、15h、30h、48h時間點采用熱踏板法測定小鼠舔后足潛伏時間，每個時間點測定5只小鼠。

1.6 小鼠坐骨神經(jīng)運(yùn)動阻滯評分 熱板實驗30s后提尾觀察小鼠后爪的伸展及屈曲能力并進(jìn)行評分。1分為足部及趾部伸展及屈曲正常；2分為足部及趾部屈曲正常，伸展能力受抑制；3分為足部及趾部尚能屈曲，但無伸展能力；4分為足部及趾部無屈曲及伸展能力，步態(tài)異常甚至出現(xiàn)拖腿現(xiàn)象。

1.7 高效液相色譜法測定小鼠血漿中羅哌卡因濃度 色譜條件：色譜柱InertSustain C18，5μm，4.6mm×250.0mm；流動相為乙腈-磷酸二氫鈉-三乙胺(48:52:0.15)，用磷酸調(diào)節(jié)pH至3.15；流速1.0ml/min；進(jìn)樣量20μl；檢測波長210nm。血漿樣品處理：各組小鼠在相應(yīng)時間點完成坐骨神經(jīng)感覺阻滯評估及運(yùn)動阻滯評分后行眼眶取血，肝素抗凝，3500r/min離心8min，離心后提取血漿0.3ml，置于–20℃冰箱中備用。分析測定時，室溫下溶解血漿標(biāo)本，取200μl，加入100μl甲醇，漩渦混勻3min，10 000r/min離心10min后取上清液，注入液相色譜儀。血藥濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取空白小鼠血清0.5ml，加入不同濃度的羅哌卡因?qū)φ掌啡芤?，配制成濃度?.025~1μg/ml羅哌卡因血漿樣品，按樣品處理方法操作進(jìn)行色譜分析，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出不同時間點的血藥濃度。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。計量資料以表示，符合正態(tài)分布者采用配對t檢驗，不符合正態(tài)分布者采用Wilcoxon秩檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 感覺阻滯的評估 在植入羅哌卡因乳酸-蓖麻油共聚物微球后3h，C組小鼠給藥側(cè)肢體出現(xiàn)明顯的感覺阻滯效果，反應(yīng)時間較B組明顯延長，10h時藥效達(dá)到最強(qiáng)，30h時藥效明顯降低，48h時藥效基本消退。C組給藥后起效時間與B組相比較慢(表1)。

表1 小鼠熱踏板縮足反應(yīng)潛伏時間(s，±s，n=5)Tab. 1 Paw withdrawal thermal latency of the mice measured by hot plate (s, ±s, n=5)

表1 小鼠熱踏板縮足反應(yīng)潛伏時間(s，±s，n=5)Tab. 1 Paw withdrawal thermal latency of the mice measured by hot plate (s, ±s, n=5)

(1)P<0.05 compared with group A; (2)P<0.05 compared with group B

Time Group A Group B Group C 10min 12.31±1.21 13.35±1.22 13.54±1.45 30min 12.51±1.82 15.51±1.88(1) 13.81±1.82 1h 13.12±1.33 26.12±0.93(1) 13.41±2.00 3h 12.30±1.51 17.30±1.45(1) 16.31±1.55(1)5h 11.51±1.72 15.51±1.82(1) 18.31±0.81(1)7h 13.32±2.01 13.32±1.02 20.31±2.20(1)(2)10h 12.31±1.20 12.11±1.24 22.31±1.45(1)(2)15h 11.31±0.91 12.00±1.11 22.31±1.65(1)(2)30h 11.81±1.81 13.81±0.82 18.31±1.89(1)(2)48h 13.45±1.14 12.20±1.22 15.31±1.14

2.2 運(yùn)動阻滯評分 A組小鼠肢體均無運(yùn)動阻滯現(xiàn)象，運(yùn)動阻滯評分為1分。B組小鼠1h時30%運(yùn)動阻滯評分為3分，70%運(yùn)動阻滯評分為2分，阻滯效果達(dá)到最強(qiáng)(P=0.003)；10h后基本恢復(fù)正常。C組小鼠3h時75%給藥側(cè)肢體運(yùn)動阻滯評分為2分，25%為1分(P=0.015)；10h后80%運(yùn)動阻滯評分為2分，20%為3分，阻滯效果達(dá)到最強(qiáng)(P=0.008)；30h時40%運(yùn)動阻滯評分為1分，60%運(yùn)動阻滯評分為2分，運(yùn)動阻滯開始恢復(fù)(P=0.05)；48h后基本恢復(fù)正常(P=0.317)。各時間點各組小鼠行走及步態(tài)均未見明顯異常。

2.3 血藥濃度測定結(jié)果 C組小鼠羅哌卡因血藥濃度在3h內(nèi)上升較快，隨后繼續(xù)上升，10h達(dá)峰值，為121.25ng/ml，此后開始逐漸下降，48h后降至較低濃度。B組小鼠羅哌卡因血藥濃度在1h內(nèi)迅速上升，并于1h時達(dá)峰值，為199.87ng/ml，此后迅速下降，7h后基本消除完全。與B組比較，C組小鼠血漿羅哌卡因濃度上升速度較慢，波動范圍較小(圖1)。

3 討 論

圖1 小鼠血漿羅哌卡因濃度-時間曲線Fig. 1 Plasma ropivacaine concentration - time curve of mice

羅哌卡因是臨床上大量用于治療急、慢性疼痛的局麻藥物，具有高度的感覺-運(yùn)動神經(jīng)阻滯分離特性，低濃度時以感覺神經(jīng)阻滯為主，無進(jìn)行性的運(yùn)動神經(jīng)阻滯，提高了患者迅速恢復(fù)運(yùn)動的可能性，而且具有中樞神經(jīng)和心血管毒性低、作用時間較長的特點[9-10]，更適用于各種疼痛的治療。聚乳酸(polylactic acid，PLA)是一種可生物降解材料，能被自然界中微生物完全降解為二氧化碳和水，不污染環(huán)境，因此在環(huán)保材料和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域具有非常廣闊的應(yīng)用前景，已有眾多學(xué)者將其用于藥物緩釋微球技術(shù)的研究[11-14]。蓖麻油是從蓖麻籽中提取的一種幾乎無色或微帶黃色的澄清黏稠液體，其中將近90%的成分為蓖麻油酸，其余的脂肪酸包括亞油酸、硬脂酸、棕櫚酸等。已有蓖麻油與乳酸共聚合成高聚物作為藥物緩釋載體的相關(guān)報道[15-18]。

本實驗室前期已成功將乳酸-蓖麻油共聚物作為羅哌卡因的載體材料，合成了羅哌卡因乳酸-蓖麻油共聚物緩釋微球，研究發(fā)現(xiàn)其在體外可緩慢穩(wěn)定釋放，7d內(nèi)約釋放80%。乳酸-蓖麻油共聚物空白微球?qū)π∈笞巧窠?jīng)無阻滯作用，因此本實驗中用于空白對照組。本研究結(jié)果表明，羅哌卡因乳酸-蓖麻油共聚物微球在小鼠坐骨神經(jīng)旁可發(fā)揮較好的緩釋作用，其熱痛覺阻滯時間較羅哌卡因注射液明顯延長，可達(dá)到48h的感覺阻滯效果，而運(yùn)動阻滯作用輕微，在臨床鎮(zhèn)痛方面具有重要的研究價值。血藥濃度測定結(jié)果表明羅哌卡因乳酸-蓖麻油共聚物微球清除時間明顯延長，血藥濃度低，波動幅度小。因為研究初期合成的微球粒徑大，載藥量較少，血藥濃度低，使鎮(zhèn)痛效果降低，后續(xù)研究中將進(jìn)一步探討如何提高微球載藥量、提高血藥濃度。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Wu CL, Raja SN. Treatment of acute postoperative pain[J].Lancet, 2011, 377(9784): 2215-2225.

[2]Deng F, Lu R, Zhang H. Effect of exposure to anesthesia on the functions of nervous system of children in the growth period[J].Med J Chin PLA, 2015, 40(3): 248-254. [鄧菲, 蘆睿, 張惠. 麻醉暴露對發(fā)育期兒童神經(jīng)系統(tǒng)功能的影響[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 40 (3): 248-254.]

[3]Li M, Guo ZH, Xie YD,et al. Effect of propranolol on the expression of growth factors and apoptotic factors related to infantile hemangiomas[J]. Med J Chin PLA, 2015, 40(3): 121-127. [李銘, 郭志輝, 謝義德, 等. 口服普萘洛爾對嬰幼兒血管瘤相關(guān)生長因子及凋亡因子表達(dá)水平的影響[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2015, 40(3): 121-127.]

[4]Barreveld A, Witte J, Chahal H,et al. Preventive analgesia by local anesthetics: the reduction of postoperative pain by peripheral nerve blocks and intravenous drugs[J]. Anesth Analg,2013, 116(5): 1141-1161.

[5]Zorzetto L, Brambilla P, Marcello E,et al. From microto nanostructured implantable device for local anesthetic delivery[J]. Int J Nanomedicine, 2016, 11: 2695-2709.

[6]Grant SA, Nielsen KC, Greengrass RA,et al. Continuous peripheral nerve block for ambulatory surgery[J]. Reg Anesth Pain Med, 2001, 26(3): 209-214.

[7]Ilfeld BM. Continuous peripheral nerve blocks: a review of the published evidence[J]. Anesth Analg, 2011, 113(4): 904-925.

[8]Weiniger CF, Golovanevski L, Domb AJ,et al. Extended release formulations for local anaesthetic agents[J]. Anaesthesia, 2012,67(8): 906-916.

[9]Li TF, Fan H,Wang YX. Epidural sustained release ropivacaine prolongs anti-allodynia and anti-hyperalgesia in developing and established neuropathic pain[J]. PLoS One, 2015, 10(1):e0117321.

[10]Li H, Liu T, Zhu Y,et al. Anin situ-forming phospholipid-based phase transition gel prolongs the duration of local anesthesia for ropivacaine with minimal toxicity[J]. Acta Biomater, 2017, 58:136-145.

[11]Zhang Z, Wu L, Li H,et al. Drug release characteristics and tissue distribution of rifapentine polylactic acid sustained-release microspheres in rabbits after paravertebral implantation[J]. Iran Red Crescent Med J, 2016, 18(11): e38661.

[12]Ratajczak-Enselme M, Estebe JP, Dollo G,et al. Epidural,intrathecal and plasma pharmacokinetic study of epidural ropivacaine in PLGA-microspheres in sheep model[J]. Eur J Pharm Biopharm, 2009, 72(1): 54-61.

[13]Tian HJ, Chen ZQ, Wang ZF,et al. The pharmacodynamics and biocompatibility of ropivacaine loading poly (lactide-coglycolide) microspheres in mice[J]. J Clin Anesthesiol, 2010,26(2): 148-150. [田洪居, 陳仲清, 王照飛, 等. 羅哌卡因乳酸羥基乙酸共聚物微球在小鼠的坐骨神經(jīng)阻滯時效及生物相容性[J]. 臨床麻醉學(xué)雜志, 2010, 26(2): 148-150.]

[14]Yu RH, Chen ZQ, Chen H,et al. Pharmacokinetics and pharmacodynamics of poly (lactide-co-glycolide) microspheres containing ropivacaine and dexamethasone for sciatic nerve block in mice[J]. J South Med Univ, 2010, 30(3): 502-505. [余讓輝, 陳仲清, 陳輝, 等. 羅哌卡因-醋酸地塞米松聚乳酸羥基乙酸共聚物微球藥效學(xué)和藥動學(xué)的觀察[J]. 南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報, 2010, 30(3): 502-505.]

[15]Eckhard LH, Houri-Haddad Y, Sol A,et al. Sustained release of antibacterial lipopeptides from biodegradable polymers against oral pathogens[J]. PLoS One, 2016, 11(9): e0162537.

[16]Eckhard LH, Sol A, Abtew E,et al. Biohybrid polymerantimicrobial peptide medium against Enterococcus faecalis[J].PLoS One, 2014, 9(10): e109413.

[17]Sokolsky-Papkov M, Golovanevski L, Domb AJ,et al. Longacting poly (DL:lactic acid-castor oil) 3:7-bupivacaine formulation: effect of hydrophobic additives[J]. Pharm Res,2011, 28(12): 3265-3273.

[18]Sokolsky-Papkov M, Golovanevski L, Domb AJ,et al. Prolonged local anesthetic action through slow release from poly (lactic acid co castor oil)[J]. Pharm Res, 2009, 26(1): 32-39.