異體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞對卵巢早衰患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響

宋開靜，何援利，蔡慧華，張冬梅，黃睿淳，孫冬華

卵巢早衰(premature ovarian failure，POF)是指女性在40歲前出現(xiàn)性腺衰竭，引起月經(jīng)不規(guī)則、閉經(jīng)、不孕、圍絕經(jīng)期綜合征等表現(xiàn)的一種婦科內(nèi)分泌疾病[1]。POF的病因復(fù)雜，已知的POF病因包括遺傳、自身免疫、醫(yī)源損傷及感染等因素[2]。有證據(jù)表明，約30%的POF與自身免疫失調(diào)有關(guān)[3]。近年來陸續(xù)有研究發(fā)現(xiàn)POF患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群比例失調(diào)，主要表現(xiàn)為外周血CD4+/CD8+T淋巴細(xì)胞比值下降[4-5]，另外有研究發(fā)現(xiàn)POF患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg)數(shù)量減少[6]，可見POF與細(xì)胞免疫密切相關(guān)。

間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)因具有自我更新和多向分化潛能，被廣泛應(yīng)用于細(xì)胞替代治療和再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域[7]。此外，MSCs還具有免疫調(diào)節(jié)能力[8]。體內(nèi)外實驗表明，MSCs與外周血單個核細(xì)胞或外周血T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)可明顯增加Treg細(xì)胞的比例[9-10]。MSCs應(yīng)用于POF的眾多研究結(jié)果顯示，不同來源的MSCs均能有效改善卵巢功能，可作為組織工程的種子來源細(xì)胞[11-13]。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(ADSCs)取材方便，來源豐富，可在體外穩(wěn)定擴增，而且在多種免疫疾病的治療研究當(dāng)中均有應(yīng)用[14]。本研究選取異體脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(hADSCs)用于實驗。目前關(guān)于POF的動物實驗大多為MSCs應(yīng)用于化療誘導(dǎo)的POF模型，而MSCs應(yīng)用于免疫相關(guān)的POF的研究甚少，本研究從免疫調(diào)控的角度探討hADSCs對卵巢早衰患者外周血調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象 選擇2016年8月－2017年8月在南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院婦產(chǎn)科確診為POF的患者18例，其中POF的納入及排除標(biāo)準(zhǔn)參照課題組的前期研究[15]。本研究經(jīng)南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并獲得患者知情同意。

1.2 主要試劑和儀器 外周血淋巴細(xì)胞分離液購自天津灝洋生物有限公司；Ⅰ型膠原酶購自美國Sigma公司；成脂成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基購自賽業(yè)公司；CCK-8試劑盒購自日本同仁公司；FITC-CD4抗體、APC-CD25抗體和PE-Foxp3抗體購自美國eBioscience公司；RNA提取試劑Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑盒及RT-PCR試劑盒均購自日本TaKaRa公司；Foxp3、β-actin引物均應(yīng)用PrimerBank軟件設(shè)計，交由上海捷瑞生物有限公司合成。

1.3 方法

1.3.1 hADSCs原代分離培養(yǎng) 無菌條件下采取人體脂肪組織約10ml，PBS沖洗3遍；眼科剪剪至糊狀后加入等體積的0.1% Ⅰ型膠原酶，37℃水浴30~40min，其間不斷搖晃；1500r/min離心10min，棄上清；加入含10% FBS、100U/ml青霉素及100U/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基重懸，置于37℃、含5%CO2孵箱中培養(yǎng)，每2~3d換液。當(dāng)細(xì)胞生長至80%融合時進(jìn)行傳代，取第3代細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.3.2 hADSCs的表型鑒定及成脂成骨分化能力測定 用胰酶消化第3代hADSCs，制成1×106個/ml的單細(xì)胞懸液，每200μl細(xì)胞懸液中加入CD90、CD105、CD45和CD34抗體各10μl，室溫避光孵育30min，PBS洗滌2次后用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的表面標(biāo)志。成脂成骨誘導(dǎo)分化根據(jù)賽業(yè)公司提供的說明進(jìn)行。取第3代hADSCs接種于預(yù)先用1%明膠包被的12孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為5×103個，待細(xì)胞融合至80%時更換為誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。每3d更換1次誘導(dǎo)分化液，誘導(dǎo)培養(yǎng)21d后，采用油紅O染色進(jìn)行成脂分化鑒定，茜素紅染色進(jìn)行成骨分化鑒定。

1.3.3 外周血單個核細(xì)胞(PBMCs)的分離培養(yǎng) 月經(jīng)第2~4天或閉經(jīng)患者隨機抽取外周血10ml，置于肝素鈉抗凝管，采用密度梯度離心法分離PBMCs，將抗凝管中血液以相同體積PBS混勻，緩慢加至外周血淋巴細(xì)胞分離液中，2000r/min離心20min，收集中間層細(xì)胞，用PBS液漂洗2次，室溫下1500r/min離心10min，棄上清，得到PBMCs。

1.3.4 共培養(yǎng)體系建立 實驗分為4組，對照組為單純植物凝集素(PHA)刺激的PBMCs，其余3組為PHA刺激的PBMCs分別與梯度濃度的hADSCs共培養(yǎng)。具體步驟如下：將1×104、2×104、1×105個hADSCs分別接種于24孔板；次日每孔接種1×105個PBMCs，并加入5μg/ml的PHA；置于37℃、含5%CO2孵箱中共培養(yǎng)72h。

1.3.5 CCK-8法檢測淋巴細(xì)胞的增殖率 共培養(yǎng)72h后，收集上清懸浮的淋巴細(xì)胞，按照每孔1×105的密度接種于96孔板中，避光加入CCK-8，每孔10μl，置于37℃培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h，酶標(biāo)儀檢測450nm波長的吸光度(A)值。

1.3.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞在CD4+細(xì)胞中所占比例 共培養(yǎng)72h后，收集上清懸浮的淋巴細(xì)胞，實驗管和同型對照管分別加入10μl FITC標(biāo)記的CD4以及APC標(biāo)記的CD25單抗，4℃避光孵育30min，經(jīng)固定破膜后，實驗管加入10μl PE標(biāo)記的Foxp3抗體，對照管中加入相應(yīng)的同型對照，避光孵育30min，最后加200μl 4%多聚甲醛固定，4℃過夜，次日采用流式細(xì)胞儀檢測CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞在CD4+細(xì)胞中所占比例。

1.3.7 實時熒光定量PCR檢測Foxp3 mRNA水平 共培養(yǎng)72h后收集上清懸浮的淋巴細(xì)胞，提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄為cDNA，操作步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。實時定量PCR采用SYBR熒光法，引物序列如下。Foxp3：正義5'-CCCAGGAAAGACAGCAACCTT-3'，反義5'-CAAACAGGCCGCCGTCTGGAGCC-3'；β-actin：正義5'-TGGAATCCTGTGGCATCCATGAAA C-3'，反義5'-TAAAACGCAGCTCAGTAACAGTCCG-3'。反應(yīng)體系10μl，充分混勻。每個標(biāo)本3個復(fù)孔，PCR反應(yīng)在Light Cycler 480高通量實時熒光定量PCR儀上進(jìn)行。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有實驗數(shù)據(jù)以表示，組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較如方差齊采用LSD-t檢驗，方差不齊采用Dunnett-T3法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 hADSCs的形態(tài)學(xué)觀察以及免疫表型和分化能力鑒定 接種24h后大部分原代細(xì)胞貼壁，傳至第3代后細(xì)胞趨于穩(wěn)定，鏡下觀察呈長梭狀或纖維狀(圖1A)。流式結(jié)果顯示細(xì)胞高表達(dá)CD90、CD105，低表達(dá)CD34和CD45(圖2)。經(jīng)成脂、成骨誘導(dǎo)分化后，油紅O和茜素紅染色陽性(圖1B、C)。

圖1 hADSCs的形態(tài)學(xué)觀察及分化能力鑒定Fig.1 Morphology and differentiation ability of hADSCs

圖2 hADSCs的免疫表型鑒定Fig.2 Immune phenotypes of hADSCs

2.2 hADSCs與PBMCs共培養(yǎng)的鏡下觀察結(jié)果 在光學(xué)顯微鏡下觀察到PHA促進(jìn)了PBMCs的增殖，細(xì)胞呈團簇樣聚集生長。隨著ADSCs濃度的增加，增殖效果降低。提示ADSCs能夠抑制PHA刺激引起的PBMCs增殖(圖3)。

2.3 CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞在CD4+細(xì)胞中所占比例 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示，與對照組(1.29%±0.50%)相比，加入1×104、2×104、1×103個hADSCs后CD4+CD25+Foxp3+Treg在CD4+細(xì)胞中所占比例(分別為5.91%±1.27%，7.76%±0.84%，8.17%±1.20%)均明顯增高，且呈劑量依賴性，其中加入1×105個hADSCs的效果最為明顯(P<0.05，圖4)。

圖3 hADSCs與PBMCs共培養(yǎng)的鏡下觀察Fig.3 Co-cultures of hADSCs and PBMCs (Observed under microscope)

2.4 淋巴細(xì)胞的增殖率 CCK-8法檢測結(jié)果顯示，與對照組(1.514±0.047)相比，不同數(shù)量級的hADSCs均能抑制淋巴細(xì)胞的增殖，且呈劑量依賴性(0.914±0.065、0.723±0.072、0.354±0.048)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

2.5 Foxp3 mRNA表達(dá)水平 實時熒光定量PCR檢測結(jié)果顯示，與對照組(1.000±0.000)相比，不同數(shù)量級的hADSCs均能明顯上調(diào)Foxp3 mRNA的表達(dá)水平(4.100±0.826、6.315±0.437、12.879±2.028)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001)。

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg細(xì)胞在CD4+細(xì)胞中所占比例Fig.4 Proportion of CD4+ CD25+ Foxp3+ Treg cells in CD4+ cells (Flow cytometry)

3 討 論

POF是一種病因復(fù)雜的婦科內(nèi)分泌疾病，目前的治療方法主要包括激素替代治療、贈卵移植、卵巢移植等，但尚不能達(dá)到恢復(fù)生育能力的效果，且部分治療方法受倫理影響較大，限制了其臨床應(yīng)用。近年來有研究發(fā)現(xiàn)，POF的發(fā)病機制與自身免疫紊亂密切相關(guān)，POF患者外周血Treg細(xì)胞數(shù)量明顯減少[6]。因此，尋求能夠促進(jìn)Treg細(xì)胞增殖的有效方法可能是成功治療POF的關(guān)鍵。在本研究中，將hADSCs與POF患者的PBMCs共培養(yǎng)，結(jié)果證實hADSCs可以促進(jìn)Treg細(xì)胞的增殖，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能。

Treg細(xì)胞是一類具有免疫抑制和免疫調(diào)節(jié)功能的T細(xì)胞亞型，其正常生理功能對于機體維持免疫穩(wěn)態(tài)必不可少[16]。轉(zhuǎn)錄因子Foxp3特異性表達(dá)于Treg細(xì)胞，是Treg細(xì)胞最可靠的分子標(biāo)志，對Treg細(xì)胞的發(fā)育及功能發(fā)揮起著關(guān)鍵作用。Foxp3功能缺失將導(dǎo)致Treg細(xì)胞數(shù)量減少、功能減弱，從而導(dǎo)致自身免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生，因此，其在一定程度上可反映Treg細(xì)胞的水平[17-18]。相關(guān)研究已經(jīng)證實，輸入體外擴增的Treg細(xì)胞可以治療多種免疫性疾病[19-20]，但是其在體內(nèi)炎癥的微環(huán)境下，發(fā)揮免疫抑制功能的效果尚不穩(wěn)定[21]。另外，影響Treg細(xì)胞用于免疫治療的因素還有很多，例如無菌性、純度、低溫凍存等問題，因而限制了其在臨床的應(yīng)用。

MSCs能在體內(nèi)外發(fā)揮免疫抑制作用，具有極大的臨床應(yīng)用價值。各種不同來源的MSCs治療卵巢早衰的動物實驗都取得了一定的效果。Badawy等[11]的研究證實，在小鼠模型中，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)修復(fù)了環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的卵巢早衰，卵巢的形態(tài)學(xué)分析顯示有新的原始卵泡形成，激素水平恢復(fù)至接近正常，注射了BMSCs的POF小鼠最終能夠恢復(fù)受孕能力。Song等[13]將人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(UCMSCs)通過尾靜脈和卵巢原位兩種方式移植入環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的卵巢早衰大鼠模型中，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，移植后的UCMSCs可以存在于卵巢組織中，并能存活較長時間。人類的UCMSCs移植除了減少卵巢細(xì)胞凋亡外，還恢復(fù)了POF大鼠的激素分泌和卵泡發(fā)育。付霞霏等[22]的研究表明，UCMSCs移植可修復(fù)透明帶免疫損傷的卵巢組織，從而部分改善其內(nèi)分泌功能。由此可見，干細(xì)胞應(yīng)用于卵巢早衰取得的成果使卵巢功能以及生育能力的恢復(fù)成為可能。

本實驗所培養(yǎng)的細(xì)胞高表達(dá)CD90、CD105，低表達(dá)CD34和CD45，同時具備成脂、成骨分化能力，證實所獲得的細(xì)胞符合干細(xì)胞特征，可用于hADSCs與Treg細(xì)胞共培養(yǎng)的實驗研究。羅利梅等[23]將BMSCs與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者來源的T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，得出BMSCs能抑制SLE患者T細(xì)胞增殖并促進(jìn)T細(xì)胞向Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化的結(jié)論。另外，Hong等[24]將人牙髓間充質(zhì)干細(xì)胞(DP-MSC)與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)，結(jié)果顯示DP-MSC可以通過促進(jìn)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)免疫耐受。本實驗結(jié)果也顯示，與對照組相比，不同數(shù)量級的hADSCs均能促進(jìn)CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞增殖并上調(diào)Foxp3 mRNA的表達(dá)，且該作用隨hADSCs數(shù)量的增高而增強。因此推測hADSCs對POF患者Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用可能與上調(diào)Foxp3的表達(dá)有關(guān)，F(xiàn)oxp3高表達(dá)可進(jìn)一步促進(jìn)Treg細(xì)胞數(shù)量增加，進(jìn)而促進(jìn)Treg細(xì)胞發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用。另外，還有研究發(fā)現(xiàn)MSCs的免疫抑制活性可能受到炎癥環(huán)境因素影響，其免疫調(diào)節(jié)功能被認(rèn)為是可溶性因子分泌和細(xì)胞直接接觸的結(jié)果，MSCs分泌某些細(xì)胞因子和趨化因子，可誘導(dǎo)Treg細(xì)胞分化，然后，這些新生成的Treg細(xì)胞能夠增強MSCs的免疫耐受性和免疫調(diào)節(jié)功能[25]。因此，我們推測它們之間可能具有協(xié)同作用，共同發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能，具體的機制還有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，hADSCs能促進(jìn)卵巢早衰患者外周血Treg細(xì)胞的增殖，從而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，這為POF的免疫治療供了一條嶄新的途徑。但本研究僅限于體外，hADSCs在體內(nèi)如何發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用仍有待進(jìn)一步探討。

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