線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白70在高糖高脂誘導(dǎo)的心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷中的作用

侯娟妮，杜勁，李秀川，陳莎，馮健，馮娟，田玥，楊怡，裴海峰，楊大春

良好的心臟微血管功能對(duì)維持心臟的循環(huán)平衡和生理功能至關(guān)重要[1-2]，心臟微血管損傷在糖尿病心血管功能障礙中發(fā)揮著非常重要的作用。大量研究表明，血脂異常是糖尿病并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的主要因素[3-5]，67.1%的糖尿病患者伴有血脂異常[6]。線粒體是細(xì)胞存活所必需的復(fù)雜細(xì)胞器，其結(jié)構(gòu)和功能異常在糖尿病心血管損傷中占據(jù)重要地位。線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白70(translocase of the outer mitochondrial membrane 70，Tom70)是線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白中的一種，可將上千種線粒體外合成的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)發(fā)揮生理作用，決定著線粒體的形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能[7]。Tom70在心肌肥厚、心力衰竭、心肌缺血/再灌注損傷等多種心血管疾病中均發(fā)揮一定的保護(hù)作用，而在糖尿病心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞(cardiac microvascular endothelial cells，CMECs)損傷中的具體作用目前尚不明確。本研究初步探索高糖高脂條件下CMECs中Tom70的可能作用及機(jī)制，旨在為糖尿病心臟微血管損傷的防治提供新的治療靶點(diǎn)和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑 小鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞系(mouse cardiac microvascular endothelial cells，MCMECs)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心提供。低糖型DMEM培養(yǎng)基、高糖型DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)HyClone公司)；胎牛血清(美國(guó)Sigma公司)；Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)；反轉(zhuǎn)錄及PCR檢測(cè)試劑盒(日本TaKaRa公司)；RT-qPCR引物(成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司)；胰酶(美國(guó)Sigma公司)；凋亡試劑盒(美國(guó)BD公司)；二氫乙啶(dihydroethidium，DHE，中國(guó)碧云天)；Lipofectamine 2000、Tom70-siRNA及Scramble siRNA(美國(guó)Invitrogen公司)；范威氏因子(von villebrand factor，vWF)一抗、Tom70一抗、GAPDH一抗及山羊抗兔二抗(美國(guó)Abcam公司)；活性氧ELISA試劑盒、一氧化氮ELISA試劑盒(深圳貝賽維斯)；抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine，NAC，中國(guó)碧云天)。

1.2 MCMECs的培養(yǎng)及分組 細(xì)胞在低糖培養(yǎng)基中生長(zhǎng)融合至80%~90%時(shí)，用0.25%含EDTA的胰蛋白酶消化，按1:2將細(xì)胞懸液接種于培養(yǎng)瓶中，置于5% CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。選擇生長(zhǎng)良好的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，接種于培養(yǎng)皿中并按分組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。將油酸(0.33mmol/L)和棕櫚酸(0.17mmol/L)按比例混合模擬高脂環(huán)境[8]，通過(guò)前期的預(yù)實(shí)驗(yàn)選擇最佳高脂干預(yù)濃度500μmol/L，干預(yù)時(shí)間16h。將MCMECs分為正常糖組(NG組，給予5.5mmol/L葡萄糖)、高糖組(HG組，給予25mmo1/L葡萄糖)和高糖高脂組(HG+HF組，給予25mmo1/L葡萄糖和500μmol/L混和脂肪酸)。為探索Tom70在高糖高脂誘導(dǎo)MCMECs損傷中的作用及機(jī)制，利用特異性siRNA技術(shù)敲低Tom70表達(dá)，進(jìn)一步將HG+HF組分為對(duì)照組(control組僅轉(zhuǎn)染試劑)、陰性對(duì)照siRNA組(Negative siRNAxeg組，轉(zhuǎn)染試劑+非特異陰性Scramble siRNA)、Tom70-siRNA組(轉(zhuǎn)染試劑+Tom70特異性siRNA)。為進(jìn)一步探索Tom70是否通過(guò)氧化應(yīng)激發(fā)揮作用，在高糖高脂和Tom70敲低基礎(chǔ)上，再將細(xì)胞分為不含NAC組(僅DMSO干預(yù))和含NAC組(5mmol/L，6h)。

1.3 細(xì)胞siRNA的轉(zhuǎn)染 在siRNA轉(zhuǎn)染前，將細(xì)胞接種于6孔板，在含有10% FBS的無(wú)抗生素低糖DMEM中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至40%后用于轉(zhuǎn)染；將轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(20μl/ml)和Tom70-siRNA或negative siRNA(終濃度為50nmol/L)分別用培養(yǎng)基稀釋并孵育5min，將稀釋的溶液分別混合在一起再室溫孵育20min；在此期間，用PBS洗滌細(xì)胞，每孔加入DMEM 1500μl；隨后，將孵育好的轉(zhuǎn)染試劑加至各孔。繼續(xù)培養(yǎng)4h后在顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染是否成功。將上述細(xì)胞在含有10%FBS的DMEM中繼續(xù)培養(yǎng)，44h后提取mRNA、68h后提取蛋白質(zhì)。其中構(gòu)建的Tom70-siRNA包含3對(duì)獨(dú)立序列，分別為：正義5'-CUAUGAACUCAGACGUUUATT-3'，反義5'-UAAACGUCUGAGUUCAUAGTT-3'；正義5'-CCGUGCCUAUUCCAUAGUATT-3'，反義5'-UACUAUGGAAUAGGCACGGTT-3'；正義5'-GUUAGCCUAUGGCUGAUAUTT-3'，反義5'-AUAUCAGCCAUAGGCUAACTT-3'。

1.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MCMECs凋亡水平 采用0.25%不含EDTA的胰酶消化收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS洗滌后以Binding Buffer重懸細(xì)胞，加入Annexin V-FITC混勻后，室溫避光孵育15min，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)前5min再加入PI染液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡，F(xiàn)lowjo軟件分析數(shù)據(jù)。

1.5 ELISA測(cè)定MCMECs上清中活性氧簇(ROS)和一氧化氮(NO)含量 超聲裂解MCMECs，12 000×g離心5min取細(xì)胞上清液，按說(shuō)明書操作分別測(cè)定ROS和NO含量。

1.6 RT-qPCR檢測(cè)MCMECs中Tom70 mRNA表達(dá)水平 采用Trizol法提取MCMECs總RNA，再反轉(zhuǎn)錄為cDNA，qPCR進(jìn)行基因擴(kuò)增，以GADPH為內(nèi)參基因，用2–ΔΔCt法處理數(shù)據(jù)。擴(kuò)增引物序列如下。Tom70：正義5'-GACAAGGAGGGAGAGGCTTT-3'，反義5'-A AGGTGGCTCGCAGA AGTA A-3'；GADPH：正義5'-GGGCTTGTCTCTGGTGTGAC-3'，反義5'-GTTGCTGTTGAAGTCGCAGG-3'。

1.7 Western blotting檢測(cè)MCMECs中Tom70蛋白含量 取50μg蛋白樣品，按常規(guī)方法電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，再分別與抗Tom70抗體(1:200)、抗GAPDH抗體(1:3000)孵育，結(jié)合二抗并以化學(xué)發(fā)光法顯跡，采用凝膠圖像分析系統(tǒng)對(duì)條帶進(jìn)行密度掃描，用Image J軟件分析灰度值。

1.8 細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)vWF因子及Tom70蛋白表達(dá) 細(xì)胞干預(yù)完成后棄去培養(yǎng)基，以4%多聚甲醛室溫固定30min，0.2%Triton X-100透化2~5min，5%BSA室溫封閉30min；加入vWF因子和Tom70一抗(1:200)，4℃過(guò)夜；加入熒光素標(biāo)記的二抗，37℃避光孵育30min；DAPI 以1:500濃度滴于培養(yǎng)皿，室溫孵育5min；以上每步均須采用新鮮制備的PBS清洗，最后保持濕潤(rùn)，激光共聚焦顯微鏡下觀察。

1.9 DHE染色觀察ROS的生成 將DHE熒光探針按5μmol/L濃度用培養(yǎng)基稀釋后加入到各組細(xì)胞中，各設(shè)3個(gè)復(fù)孔，37℃避光孵育30min，采用激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)DHE熒光水平。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)量資料以表示，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 高糖高脂對(duì)MCMECs及Tom70表達(dá)的影響 流式細(xì)胞及ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，相比正常糖水平，高糖培養(yǎng)條件下，MCMECs凋亡率明顯增高，NO生成減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而同時(shí)給予高脂可加劇這些損傷(P<0.05，圖1A、B)，表明高糖高脂可對(duì)MCMECs造成損傷。RT-qPCR及細(xì)胞免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，與NG組比較，HG組和HG+HF組Tom70 mRNA及蛋白表達(dá)水平均明顯降低，而HG+HF組較HG組降低更為明顯，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖1C、D)，表明Tom70在心臟微血管內(nèi)皮有表達(dá)，高糖可導(dǎo)致Tom70表達(dá)下降，疊加高脂可加劇該效應(yīng)。

圖1 高糖高脂對(duì)MCMECs損傷及其Tom70表達(dá)的影響Fig.1 Effects of high glucose and high fat on MCMECs injury and Tom70 expression

2.2 高糖高脂對(duì)ROS生成的影響 DHE染色和ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，相比NG組，高糖可增加ROS的生成；而HG+HF比HG誘導(dǎo)ROS生成的作用更顯著(P<0.05，圖2)，提示氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng)是高糖高脂損傷MCMECs的原因之一。

2.3 Tom70缺失對(duì)MCMECs損傷的影響 RT-qPCR和Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，Tom70-siRNA組Tom70的表達(dá)較對(duì)照組和陰性對(duì)照siRNA組顯著降低，表明Tom70的表達(dá)已被成功抑制(P<0.01，圖3A、B)。流式細(xì)胞術(shù)及ELISA檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Tom70缺失的MCMECs凋亡率明顯增加，NO生成明顯減少(P<0.01，圖3C、D)。提示Tom70是高糖高脂環(huán)境下MCMECs的保護(hù)性分子。

2.4 下調(diào)Tom70對(duì)ROS生成的影響 DHE染色和ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示，Tom70-siRNA轉(zhuǎn)染所致Tom70缺失明顯增加了細(xì)胞內(nèi)ROS的生成(P<0.01，圖4A、B)。

2.5 NAC部分逆轉(zhuǎn)Tom70缺失對(duì)MCMECs損傷的影響 ELISA及流式細(xì)胞檢測(cè)結(jié)果顯示，同樣轉(zhuǎn)染Tom70-siRNA的細(xì)胞，在用抗氧化劑NAC(5mmol/L)干預(yù)6h后，MCMECs中ROS及細(xì)胞凋亡水平明顯降低，NO生成明顯增加(P<0.05，圖5)，表明Tom70作用的發(fā)揮與氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

圖2 高糖高脂對(duì)ROS生成的影響Fig.2 Effects of high glucose and high fat on the generation of ROS

圖3 Tom70缺失對(duì)MCMECs的影響Fig.3 Effect of Tom70 deletion on MCMECs

圖4 Tom70缺失對(duì)ROS生成的影響Fig.4 Effects of Tom70 deletion on the generation of ROS

圖5 NAC對(duì)Tom70缺失所致MCMECs損傷的影響Fig.5 Effect of NAC on MCMECs injury induced by Tom70 deletion

3 討 論

國(guó)際糖尿病聯(lián)盟2017年最新數(shù)據(jù)顯示，全球有糖尿病患者4.25億，其中中國(guó)患者1.144億，發(fā)病率高達(dá)10.9%，居全球第一。糖尿病可導(dǎo)致心臟微血管病變、心肌代謝異常及心肌纖維化等多種心血管損傷，心血管并發(fā)癥已成為糖尿病患者的首要死因，而CMECs受損被認(rèn)為是導(dǎo)致糖尿病心血管并發(fā)癥的主要原因[9]。糖尿病CMECs的過(guò)度凋亡可能導(dǎo)致微血管屏障功能障礙，造成心肌代謝異常和細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)受損[10]；如同冠狀動(dòng)脈狹窄一樣，心臟微血管功能障礙還可導(dǎo)致心肌缺氧[11]。血脂異?？赡苁翘悄虿⌒难懿l(fā)癥高發(fā)的原因之一[12]。研究表明，高血脂是2型糖尿病、缺血性心臟病、心力衰竭等疾病的重要的危險(xiǎn)因素[13]，而降脂藥物在心血管病防治中具有較理想的作用[14]。因此，深入研究高糖高脂狀態(tài)下心血管損傷的分子機(jī)制和干預(yù)靶點(diǎn)非常有意義。本課題組前期實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，高糖顯著增加了MCMECs的凋亡，減少了NO的生成，而高脂會(huì)進(jìn)一步影響內(nèi)皮的存活和功能，提示合并高脂血癥會(huì)進(jìn)一步加重糖尿病CMECs損傷，故控制血糖和血脂同等重要。

線粒體是真核細(xì)胞中高度活躍的細(xì)胞器，在細(xì)胞能量轉(zhuǎn)換、代謝和凋亡中發(fā)揮著重要的作用，而這些作用的發(fā)揮離不開(kāi)線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白。線粒體作為決定真核細(xì)胞生死存亡的“產(chǎn)能工廠”，其內(nèi)部含有1 000余種蛋白質(zhì)，約99%在線粒體外合成后經(jīng)線粒體外膜上的線粒體外膜轉(zhuǎn)位酶(translocase of the outer mitochondrial membrane，Tom)復(fù)合物運(yùn)輸，轉(zhuǎn)運(yùn)至線粒體內(nèi)部發(fā)揮其相應(yīng)的生理功能[15]。Tom復(fù)合物決定了線粒體前體蛋白的輸入，對(duì)維持病理生理?xiàng)l件下的線粒體功能至關(guān)重要。Tom復(fù)合物主要由Tom70、Tom40和Tom22等多種亞基組成，Tom70屬于其中最外側(cè)的一種亞型。Li等[16]研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Tom70表達(dá)可導(dǎo)致病理性心肌細(xì)胞肥大；Pei等[17]發(fā)現(xiàn)，上調(diào)Tom70表達(dá)可有效減輕缺血后心肌損傷。這些研究均提示Tom70可能在心血管疾病中發(fā)揮著重要作用。截至目前，Tom70在血管內(nèi)皮中的表達(dá)情況及在糖尿病狀態(tài)下的表達(dá)變化等仍未闡明。本研究發(fā)現(xiàn)，Tom70不僅在心臟微血管內(nèi)皮中有表達(dá)，而且在高糖高脂干預(yù)后明顯下降，提示Tom70可能在糖尿病CMECs損傷中也發(fā)揮一定作用。為了進(jìn)一步探索Tom70的作用情況，以特異性siRNA敲低Tom70水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Tom70會(huì)進(jìn)一步加重MCMECs凋亡、減少NO生成，即Tom70缺失會(huì)加重糖尿病CMECs的損傷和功能紊亂，提示Tom70可作為糖尿病心臟微血管損傷的治療靶點(diǎn)來(lái)深入研究。

氧化應(yīng)激是ROS生成和清除失衡的結(jié)果，越來(lái)越多的證據(jù)表明，氧化應(yīng)激在糖尿病并發(fā)癥的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用，而氧化應(yīng)激是否介導(dǎo)了線粒體功能蛋白Tom70的內(nèi)皮保護(hù)作用尚屬未知。大量研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病可增加血管內(nèi)皮ROS生成，誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，最終影響微血管屏障功能、心臟功能和心肌糖代謝等[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖高脂可增加ROS生成，該結(jié)果與現(xiàn)有的研究一致[19]。還有研究發(fā)現(xiàn)Tom70缺失會(huì)損傷心肌細(xì)胞的線粒體完整性，促進(jìn)ROS產(chǎn)生，最終加重細(xì)胞損傷[17]。本研究也發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Tom70會(huì)進(jìn)一步加重氧化應(yīng)激反應(yīng)，這可能與Tom70缺失導(dǎo)致線粒體功能紊亂有關(guān)，值得在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中繼續(xù)驗(yàn)證；而應(yīng)用抗氧化劑NAC部分逆轉(zhuǎn)了Tom70缺失后內(nèi)皮細(xì)胞的高氧化應(yīng)激水平和不良作用，提示Tom70參與了內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)過(guò)程。這些結(jié)果提示，ROS過(guò)載是糖尿病微血管內(nèi)皮損傷的重要誘因，高糖高脂可能通過(guò)抑制Tom70表達(dá)加重氧化應(yīng)激反應(yīng)，最終導(dǎo)致糖尿病心臟微血管損傷。后期本課題組將引入腺病毒過(guò)表達(dá)技術(shù)繼續(xù)觀察Tom70與氧化應(yīng)激之間的關(guān)系。

綜上所述，高脂可進(jìn)一步加劇糖尿病心臟微血管內(nèi)皮損傷，Tom70可能通過(guò)氧化應(yīng)激途徑介入高糖高脂心臟微血管損傷的調(diào)控。本研究為糖尿病合并高脂血癥患者的心血管防護(hù)提供了新的視角，下一步將結(jié)合動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步闡明Tom70在糖尿病心臟微血管損傷中的保護(hù)作用。

【參考文獻(xiàn)】

[1]Ismail-Beigi F, Craven T, Banerji MA,et al. Effect of intensive treatment of hyperglycaemia on microvascular outcomes in type 2 diabetes: an analysis of the ACCORD randomised trial[J].Lancet, 2010, 376(9739): 419-430.

[2]Hao M, Li SY, Sun CK,et al. Amelioration effects of berberine on diabetic microendothelial injury model by the combination of high glucose and advanced glycation end productsin vitro[J].Eur J Pharmacol, 2011, 654(3): 320-325.

[3]Cusi K. The role of adipose tissue and lipotoxicity in the pathogenesis of type 2 diabetes[J]. Curr Diab Rep, 2010, 10(4):306-315.

[4]DeFronzo RA. Insulin resistance, lipotoxicity, type 2 diabetes and atherosclerosis: the missing links. the Claude Bernard lecture 2009[J]. Diabetologia, 2010, 53(7): 1270-1287.

[5]Du J, Hou JN, Li XC,et al. Effect of perilipin-5 on apoptosis of cardiac microvascular endothelial cells induced by high fat and high glucose in mice[J]. Med J Chin PLA, 2017, 42(12): 1045-1050. [杜勁, 侯娟妮, 李秀川, 等. 脂滴包被蛋白5對(duì)高糖高脂誘導(dǎo)的小鼠心臟微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響及機(jī)制[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2017, 42(12): 1045-1050.]

[6]Yan L, Xu MT, Yuan L,et al. Prevalence of dyslipidemia and its control in type 2 diabetes: A multicenter study in endocrinology clinics of China[J]. J Clin Lipidol, 2016, 10(1): 150-160.

[7]Liu XY, Wei B, Shi HX,et al. Tom70 mediates activation of interferon regulatory factor 3 on mitochondria[J]. Cell Res,2010, 20(9): 994-1011.

[8]Ricchi M, Odoardi MR, Carulli L,et al. Differential effect of oleic and palmitic acid on lipid accumulation and apoptosis in cultured hepatocytes[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2009, 24(5):830-840.

[9]Avogaro A, Fadini GP, Gallo A,et al. Endothelial dysfunction in type 2 diabetes mellitus[J]. Nutr Metab Cardiovasc Dis,2006,16(Suppl 1): S39-S45.

[10]Westermeier F, Riquelme JA, Pavez M,et al. New molecular insights of insulin in diabetic cardiomyopathy[J]. Front Physiol,2016, 7: 125.

[11]Marinescu MA, L?ffler AI, Ouellette M,et al. Coronary microvascular dysfunction, microvascular angina, and treatment strategies[J]. JACC Cardiovasc Imaging, 2015, 8(2): 210-220.

[12]Mazzone T. Intensive glucose lowering and cardiovascular disease prevention in diabetes: reconciling the recent clinical trial data[J]. Circulation, 2010, 122(21): 2201-2211.

[13]Goldfine AB, Beckman JA. Life and death in Denmark: lessons about diabetes and coronary heart disease[J]. Circulation, 2008,117(15): 1914-1917.

[14]Gotto AM, Moon JE. Pharmacotherapies for lipid modification:beyond the statins[J]. Nat Rev Cardiol, 2013, 10(10): 560-570.

[15]Harbauer AB, Opalinska M, Gerbeth C,et al. Mitochondria.Cell cycle-dependent regulation of mitochondrial preprotein translocase[J]. Science, 2014, 346(6213): 1109-1113.

[16]Li J, Qi M, Li C,et al. Tom70 serves as a molecular switch to determine pathological cardiac hypertrophy[J]. Cell Res, 2014,24(8): 977-993.

[17]Pei HF, Hou JN, Wei FP,et al. Melatonin attenuates postmyocardial infarction injuryviaincreasing Tom70 expression[J]. J Pineal Res, 2017, 62(1): e12371.

[18]Wang D, Luo P, Wang Y,et al. Glucagon-like peptide-1 protects against cardiac microvascular injury in diabetesviaa cAMP/PKA/Rho-dependent mechanism[J]. Diabetes, 2013, 62(5):1697-1708.

[19]Dal S, Jeandidier N, Seyfritz E,et al. Oxidative stress status and liver tissue defenses in diabetic rats during intensive subcutaneous insulin therapy[J]. Exp Biol Med, 2016, 241(2):184-192.