CYP46A1過表達對阿爾茨海默病轉(zhuǎn)基因模型小鼠的認知改善和抗炎癥作用

趙敏，孔彥瑩，嚴華成，劉樂斌，蘇建新，周志堅，于德憲，彭秋菊，謝麗

阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種以記憶減退和認知功能障礙為特征的中樞神經(jīng)退行性疾病，其病理學特征包括神經(jīng)元外大量β-淀粉樣蛋白(β-amyloid protein，Aβ)沉積形成的老年斑、皮質(zhì)神經(jīng)元內(nèi)τ蛋白異常聚集形成的神經(jīng)原纖維纏結(jié)、膠質(zhì)細胞增生以及腦內(nèi)炎性浸潤等[1]。該疾病是最常見的一種癡呆類型，發(fā)病率隨年齡的增長而增加，但其病因及發(fā)病機制目前尚不清楚。

大量研究表明，腦內(nèi)的膽固醇水平與AD的發(fā)病密切相關(guān)[2-3]。由于膽固醇不能通過血腦屏障，只有依靠其代謝產(chǎn)物才能保持在腦內(nèi)的動態(tài)平衡[4]，因此，膽固醇的主要代謝酶細胞色素P450 46A1(CYP46A1)[5-6]的表達水平及功能狀態(tài)直接影響其細胞內(nèi)水平。此外，病例對照研究發(fā)現(xiàn)，不同人種的CYP46A1基因多態(tài)性均能顯著增加AD的發(fā)病風險[7]，如果把CYP46A1的表達阻斷，小鼠腦內(nèi)會出現(xiàn)更多的Aβ沉積或神經(jīng)元死亡[8]。以上研究提示，CYP46A1可能在AD的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，但CYP46A1對于AD的治療作用目前尚未見文獻報道。本研究以AD轉(zhuǎn)基因小鼠模型作為研究對象，通過慢病毒體系轉(zhuǎn)染使小鼠腦內(nèi)過表達人源CYP46A1基因，檢測其行為學表現(xiàn)、Aβ沉積情況、星形膠質(zhì)細胞數(shù)量、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)和白細胞介素-1β(interleukin-1 beta，IL-1β)表達水平等評價指標，研究CYP46A1基因過表達對AD模型小鼠的治療作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠(雄性，3月齡，20~25g)由南方醫(yī)科大學神經(jīng)生物學教研室贈予，共表達5種家族性AD基因突變[APP K670N/M6 71L(Swedish)+716V(Florida)+V717I(London)和PS1 M146L+L286V]的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠[9]。小鼠飼養(yǎng)于標準的實驗室環(huán)境內(nèi)，溫度23±1℃、白天-黑夜循環(huán)(12h:12h)、鼠籠大小300mm×170mm×120mm，自由攝食。

1.2 實驗分組及處理 實驗一：5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠的功能檢測實驗。分別選取3月齡的5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠和野生型小鼠各12只，進行Morris水迷宮檢測，實驗結(jié)束后，每組隨機挑取3只小鼠進行ELISA檢測，另每組挑取6只小鼠進行免疫組化染色。實驗二：CYP46A1過表達干預實驗。選取3月齡的5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠24只，其中12只在雙側(cè)海馬注入含CYP46A1的慢病毒作為實驗組，另外12只則注射空載體作為對照組，感染2個月后，先進行T迷宮檢測，再進行Morris水迷宮檢測，行為學評價完成后，每組隨機選取6只取腦組織進行免疫組化染色，觀察腦內(nèi)Aβ的沉積以及星形膠質(zhì)細胞的表達情況；另外每組隨機挑選3只，通過ELISA法檢測海馬組織中Aβ40、Aβ42、TNF-α以及IL-1β的表達水平。

1.3 主要儀器和試劑 立體定位儀(Stoelting公司)，Morris水迷宮(上海吉量軟件科技有限公司)；RNAiso plus試劑和RT-PCR檢測試劑盒購自TaKaRa公司；抗CYP46A1抗體購自Proteintech公司；抗Aβ抗體購自Covance公司；抗GFAP 抗體購自Abcam公司；小鼠源性Aβ40ELISA試劑盒(KMB3481)、小鼠源性Aβ42ELISA試劑盒(KMB3411)購自Invitrogen公司；小鼠源性TNF-α ELISA試劑盒(EK0527)和小鼠源性IL-1β ELISA試劑盒(EK0394)購自武漢博士德生物工程有限公司；免疫組化染色試劑盒(SP法)購自中杉金橋公司。

1.4 5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定 剪取出生后1周的待鑒定小鼠組織(按標記部位剪?。何舶?mm左右，耳朵米粒大小，前肢或后肢取1根腳趾)，提取組織DNA，基因鑒定的PCR擴增條件如下：94℃ 2min；94℃ 30s，54℃ 1min，72℃ 1min，共45個循環(huán)。引物序列如下：App5為目的片段，上游引物為5'-AATAGAGAACGGCAGGAGCA-3'，下游引物為5'-GCCATGAGGGCACTAATCAT-3'，基因擴增產(chǎn)物為608bp；對照基因的上游引物為5'-CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT-3'，下游引物為5'-GCCATGAGGGCACTAATCAT-3'，基因擴增產(chǎn)物為324bp。PCR產(chǎn)物加入1.5%瓊脂糖凝聚電泳進行分析，若只出現(xiàn)324bp位置的條帶，則判定為野生型；若在324bp以及608bp這兩個位置均有條帶，則判定為5XFAD基因攜帶小鼠。圖1A為基因鑒定圖片。

1.5 病毒包裝及處理 常規(guī)方法制備CYP46A1過表達的慢病毒，滴度為3×108TU/ml。通過立體定位儀將病毒定位注射到3月齡的雄性5XFAD小鼠雙側(cè)海馬組織中(n=12)，對照組(n=12)則注射空載體到相應的部位，通過RT-PCR、Western blotting實驗驗證CYP46A1的過表達效果。2個月后，采用T迷宮實驗以及Morris水迷宮評價小鼠的認知狀況，通過免疫組化法觀察腦內(nèi)Aβ的沉積以及星形膠質(zhì)細胞的表達情況，通過ELISA法檢測海馬Aβ及炎癥因子的表達水平。

1.6 RT-PCR檢測CYP46A1基因mRNA的表達Trizol法提取海馬總RNA。反轉(zhuǎn)錄和PCR擴增均按照TaKaRa公司的試劑盒的說明書進行操作，CYP46A1基因引物序列如下：CYP2J2為目的片段，上游引物為5'-AGAAGTATGGTCCTGTTGTA-3'，下游引物為5'-ACATTCAGACACCAAGCC-3'，基因擴增產(chǎn)物為212bp；18S rRNA作為內(nèi)參，上游引物為5'-GATCTGGCACCACACCTT-3'，下游引物為5'-TACAGGGACAGCACAGCCT-3'，基因擴增產(chǎn)物為177bp。PCR擴增條件為：94℃ 1min；94℃ 30s，55℃ 30s，72℃ 1min，35個循環(huán)；72℃ 2min，4℃保持。

1.7 ELISA檢測 參照文獻[10]的方法，用10%水合氯醛深度麻醉小鼠，斷頭取腦，快速分離海馬，并加入2ml/g的蛋白裂解緩沖液(137mmol/L NaCl，20mmol/L Tris，1% NP-40，10%甘油，1mmol/L苯甲基磺酰氟，10μg/ml胰蛋白酶抑制劑，0.5mmol/L釩酸鈉)。研磨勻漿，4℃下2500r/min離心15min，收集上清，按照TNF-α(或IL-1β、Aβ40、Aβ42)的ELISA試劑盒操作說明書進行檢測，最后用酶標儀測定450nm處吸光度(OD)值，計算出對應的濃度。

1.8 免疫組織化學染色 參照文獻[10]的方法，用10%水合氯醛深度麻醉小鼠，剪開胸腔暴露心臟，用4%多聚甲醛經(jīng)主動脈灌注固定后取腦，放入30%蔗糖溶液中24~48h，沉底后行40μm厚冰凍切片，按照標準的SP法步驟行免疫組織化學染色。一抗分別為小鼠源性抗Aβ抗體(SIG-39220-200)和兔源性抗GFAP抗體(ab7260)，1:400稀釋；二抗分別為山羊抗小鼠IgG-HRP和Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔IgG，1:1000稀釋。Aβ抗體通過DAB染色，在普通顯微鏡下觀察，GFAP抗體直接在熒光顯微鏡下觀察。

1.9 Morris水迷宮檢測 參照文獻[11]的方法，簡述如下：每次訓練分4個步驟進行，每步均從新的入水點放入，入水前令小鼠面向池壁，記錄小鼠從入水到爬上平臺的時間(潛伏期)，如果小鼠在90s內(nèi)未找到平臺，則由實驗者將其引導上平臺，并記作90s，小鼠爬上平臺后休息30s后再進行下一次實驗，取4次訓練成績的算術(shù)平均數(shù)記為當天的潛伏期時間。經(jīng)過4d訓練之后，第5天時將平臺撤掉，讓小鼠在水池里游泳90s并記錄其軌跡，分析每只小鼠在平臺所在的象限內(nèi)游泳時間及路程占總時間和總路程的百分比。為排除感覺、視覺或運動功能障礙對空間學習記憶的影響，實驗結(jié)束后，讓平臺位置露出水面2cm，并貼上黃色膠帶，其余操作同隱蔽平臺試驗，即可視平臺試驗(cued test)。

1.10 T迷宮檢測 檢測方法[12-13]簡述如下：首先將小鼠放置在T迷宮的起始臂，讓其自由探索；當小鼠進入其中一側(cè)目標臂(以四肢均進入為標準)時，馬上關(guān)閉閘門，記錄首次進入的目標臂(左側(cè)或右側(cè))；關(guān)閉25s后，將小鼠放回鼠籠，打開所有閘門；再次將小鼠放入起始臂，讓其自由探索；記錄小鼠第2次所進入的目標臂，然后將其放回鼠籠。如果測試小鼠第2次進入了一個不同的目標臂，計得分正確1次，否則為錯誤。每只小鼠訓練2次/d，連續(xù)10d。最后計算各組小鼠在20次訓練中的平均正確率。

1.11 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 13.0軟件進行統(tǒng)計分析。Morris水迷宮訓練中的逃避潛伏期以及游泳平均速度進行重復測量數(shù)據(jù)的方差分析，并使用LSD-t法或Tamhane'sT2法進行兩兩比較。其余數(shù)據(jù)的比較采用Student'st檢驗。所有實驗結(jié)果均采用表示。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié) 果

2.1 5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠的鑒定及功能檢測 圖1A為基因鑒定時的示意圖，5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠在電泳圖中顯示有2條帶，而野生型小鼠則僅1條帶。Morris水迷宮檢測發(fā)現(xiàn)，與野生型小鼠相比，3月齡的5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠在隱蔽平臺訓練中的逃避潛伏期顯著延長(P<0.01，n=12，圖1B)，而在可視平臺試驗中的潛伏期并無明顯差異，提示該組小鼠的學習記憶能力明顯下降。行為學檢測結(jié)束后，每組各隨機選取3只小鼠取其腦組織進行ELISA檢測，另各取6只小鼠進行大腦切片并行免疫組化染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，3月齡的5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)TNF-α(P<0.001，n=3，圖1C)，IL-1β(P<0.01，n=3，圖1C)，Aβ(P<0.01，n=6)表達水平以及星形膠質(zhì)細胞的數(shù)量(P<0.01，n=6，圖1D)均比野生型小鼠有顯著上調(diào)。

2.2 腦內(nèi)過表達CYP46A1對5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠認知障礙的改善作用 RT-PCR和Western blotting檢測結(jié)果顯示，過表達人源CYP46A1(pLV-CYP46A1)的5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠，其海馬組織中CYP46A1 mRNA和蛋白表達水平均明顯高于對照組(圖2A、B)。T迷宮實驗顯示，pLV-CYP46A1組小鼠的平均正確率比對照組顯著增高(P<0.05，圖2C)。Morris水迷宮實驗顯示，pLV-CYP46A1組小鼠在獲得性訓練期間找到平臺的潛伏期比對照組小鼠顯著縮短(P<0.05，圖2D)，而兩組小鼠的游泳速度以及可視平臺試驗的潛伏期比較差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖2E)；在探查訓練期間，pLV-CYP46A1組小鼠在目標象限的時間和路程占總時間(P<0.05，圖2F)及總路程的百分比(P<0.05，圖2G)均明顯高于對照組，而其穿越的平臺次數(shù)雖比對照組有增多的趨勢，但差異無統(tǒng)計學意義(P=0.079，圖2H)。

此外，Aβ免疫組化染色以及斑塊面積統(tǒng)計顯示，pLV-CYP46A1組小鼠海馬區(qū)的淀粉樣斑塊面積顯著減少(P<0.01，圖3A、B)；ELISA實驗發(fā)現(xiàn)，該小鼠海馬區(qū)的Aβ40(P<0.05)及Aβ42的表達(P<0.01，圖3D)均明顯下降。

圖1 5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠的基因鑒定及各項指標檢測Fig. 1 Genetic identification and functional detection of 5XFAD transgenic mice

2.3 過表達CYP46A1對5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)星形膠質(zhì)細胞數(shù)量及炎癥浸潤的影響 免疫組化染色發(fā)現(xiàn)，pLV-CYP46A1組小鼠海馬區(qū)域的星形膠質(zhì)細胞數(shù)量比對照組相應部位顯著減少(P<0.05，圖3A，C)；ELISA實驗發(fā)現(xiàn)，pLV-CYP46A1組小鼠海馬區(qū)域的IL-1β和TNF-α表達水平也比對照組顯著下降(P<0.05，圖3E)。

3 討 論

AD病情呈進行性發(fā)展，但由于其病因及發(fā)病機制尚不清楚，因而尚無特效的治療藥物或方法，患者通常在確診的3~9年死亡，是本世紀危害人類健康的最嚴重疾病之一。

大腦是體內(nèi)膽固醇含量最高的組織，其膽固醇占機體總量的23%，而腦重量只占體重的2.1%。此外，膽固醇為合成神經(jīng)細胞膜所必需，在髓鞘內(nèi)含量很高，并形成脂質(zhì)筏，后者是裝配β和γ分泌酶，以及將淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)加工為Aβ的平臺[14]。當酯化膽固醇過多時，膜脂轉(zhuǎn)運減少，可致Aβ生成和聚集增多而清除減少，導致AD發(fā)生。在腦內(nèi)，CYP46A1是膽固醇代謝的主要酶[5-6]，由于膽固醇不能通過血腦屏障，它只能依靠CYP46A1將其代謝為24s-羥基膽甾醇，然后再由后者透過血腦屏障來保持其在腦內(nèi)的動態(tài)平衡[4]。在正常大腦中，CYP46A1主要表達在額葉皮質(zhì)的椎體神經(jīng)元上，而在AD患者中，此區(qū)域的神經(jīng)元大量丟失或萎縮，推測血漿24s-羥基膽甾醇的減少很有可能是由于此處含CYP46A1神經(jīng)元的死亡造成的[15]。

此外，AD的發(fā)生發(fā)展通常伴隨著星形膠質(zhì)細胞的激活以及慢性炎癥反應，前者表現(xiàn)為星形膠質(zhì)細胞數(shù)量增加、體積增大以及能動性增強，而后者則是神經(jīng)元死亡的重要原因[16]。研究發(fā)現(xiàn)，在AD患者大腦的皮質(zhì)和皮質(zhì)下結(jié)構(gòu)，存在著廣泛的星形膠質(zhì)細胞激活[17]，而激活的星形膠質(zhì)細胞能夠分泌多種炎癥因子，包括IL、TNF、干擾素(interferons，IFN)、一氧化氮(nitric oxide，NO)等，它們大部分(如IL-1β、IL-6、TNF-α等)對神經(jīng)細胞具有毒性作用，進而可引起神經(jīng)細胞的凋亡或壞死[19-20]。

圖2 腦組織過表達CYP46A1對5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠認知障礙的改善作用Fig. 2 Overexpression of CYP46A1 in brain tissue improved the cognitive impairment in 5XFAD transgenic mice

本研究采用5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠作為AD模型小鼠，該小鼠攜帶3個APP 突變基因和2個PS1突變基因[9]。本研究結(jié)果顯示，3月齡的5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠即出現(xiàn)學習記憶能力下降、腦內(nèi)老年斑塊、膠質(zhì)細胞增生以及IL-1β和TNF-α等炎癥因子表達升高(圖1B–D)，提示該轉(zhuǎn)基因小鼠與AD具有相似的功能學及病理變化特征。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)，過表達人源CYP46A1后，5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠的認知障礙得到顯著改善(圖2)，其海馬區(qū)域的Aβ斑塊面積及星形膠質(zhì)細胞數(shù)量顯著減少(圖3A–C)，同時，Aβ40、Aβ42、IL-1β和TNF-α的表達水平也均出現(xiàn)顯著下降(圖3D，E)，提示CYP46A1在AD的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用，其機制可能與減少Aβ沉積、降低腦內(nèi)炎癥反應水平有關(guān)。本研究的結(jié)果與國內(nèi)外在CYP46A1基因多態(tài)性增加AD的發(fā)病風險[7]以及阻斷CYP46A1的表達可加重AD的相關(guān)癥狀[8]等研究結(jié)果一致，并進一步證實了CYP46A1對于AD的治療價值。本研究結(jié)果為揭示AD的發(fā)生機制奠定了基礎(chǔ)，并為AD的預防和治療提供了理論基礎(chǔ)和新的靶點。

圖3 過表達CYP46A1對5XFAD轉(zhuǎn)基因小鼠腦內(nèi)Aβ沉積及炎癥浸潤的影響Fig. 3 Overexpression of CYP46A1 ameliorated the Aβ deposition and inflammatory infiltration in 5XFAD transgenic mice

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