不同炮制方法對(duì)人參皂苷含量及肝癌細(xì)胞凋亡的影響

杜瑞雪,郗艷麗,張洋婷,馮小雨,李善姬

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院,吉林 吉林 132013;2.延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院,吉林 延吉 133002)

人參(Panax ginsengC.A.Meyer),是我國(guó)名貴中草藥,有“藥草之王”之稱,傳統(tǒng)黑參是用干鮮人參作為原材料,經(jīng)九蒸九干才能制成[1]。人參皂苷是人參的主要生物活性成分,研究發(fā)現(xiàn)人參稀有皂苷具有腫瘤細(xì)胞殺傷作用、改善記憶力和抗炎作用[2-3]。特別是人參稀有皂苷Rg3,能夠減少肝癌細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移[4]。目前國(guó)內(nèi)對(duì)黑參的研究比較少,國(guó)外有研究表明,黑參在促進(jìn)新血管生成、抗氧化和抗皺等方面療效好且毒副作用小[5-6]。為了探討不同炮制方法對(duì)人參皂苷含量及抗腫瘤活性的影響,本文制人參、紅參和黑參提取液,測(cè)定人參總皂苷和稀有皂苷Rg3含量以及探討其對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的增殖抑制和促凋亡作用,旨在為人參產(chǎn)業(yè)發(fā)展與人參保健產(chǎn)品開發(fā)應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 市售的五年制人參干品(產(chǎn)地吉林),人肝癌HepG2細(xì)胞株(吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院提供)。正丁醇(分析純);甲醇(分析純、色譜純);乙腈(色譜純);人參皂苷Rg1,Re,Rb1,Rg3對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所);RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶、二甲基亞砜(美國(guó)GIBCO公司);四甲基偶氮唑藍(lán)(美國(guó)Sigma公司);Annexin V-FITC/PI雙染試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)。

1.2 儀器與設(shè)備 Dorim DHC-7000C紅參發(fā)酵鍋(韓國(guó));Agilent1260高效液相色譜儀(安捷倫科技);LC-20AT高效液相(日本島津公司產(chǎn)品);Symmetrix ODS-R C18(4.6 mm ×250 mm,5 μm)色譜柱(美國(guó)Boston Analytics公司產(chǎn)品);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52AA(上海亞榮生化儀器廠);VP50PLUS旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(美國(guó)萊伯泰科公司);雙人單面凈化工作臺(tái)(蘇州凈化設(shè)備有限公司);恒溫二氧化碳培養(yǎng)箱(Thermo);全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Olympus);倒置生物顯微鏡(Olympus);流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司)。

1.3 高效液相色譜條件 以乙腈為流動(dòng)相A,以水為流動(dòng)相B。流速:1.0 mL/min,柱溫:35℃,檢測(cè)波長(zhǎng)為 203 nm,色譜柱:C18(4.6 ×250 mm,5 μm)。將樣品按表1的梯度洗脫條件,按測(cè)定方法測(cè)定其中的總皂苷Rg1、Re、Rb1和稀有皂苷Rg3含量。

表1 梯度洗脫條件

1.4 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 精密稱取干燥的人參皂苷Rg1對(duì)照品4.06 mg、人參皂苷Re對(duì)照品4.38 mg、人參皂苷 Rb1對(duì)照品3.94 mg和人參皂苷Rg3對(duì)照品4.24 mg,加甲醇配制成10 mL溶液,即得 0.406 mg/mL人參皂苷 Rg1、0.438 mg/mL 人參皂苷 Re、0.394 mg/mL 人參皂苷Rb1、0.424 mg/mL 人參皂苷 Rg3的混合溶液,搖勻,用微孔過濾膜過濾備用。將標(biāo)準(zhǔn)品溶液的原液分別稀釋2倍、4倍、8倍、16倍,用HPLC法測(cè)定其峰面積,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5 供試品溶液的制備 人參于紅參發(fā)酵鍋中蒸制24 h可得紅參,蒸制30 h可得黑參,自然干燥備用。人參、紅參、黑參提取液制備:在紅參發(fā)酵鍋中分別放入干燥的人參、紅參、黑參,加純凈水熬18 h制得人參、紅參、黑參提取液,過濾冷藏備用。在過濾液中加水飽和正丁醇萃取3次,收集正丁醇層,然后用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干,殘?jiān)蛹状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至5 mL量筒中,加甲醇至刻度,搖勻,過濾,即得供試品溶液。

1.6 人肝癌細(xì)胞HepG2的培養(yǎng)及抑制率和凋亡率檢測(cè) 細(xì)胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,將實(shí)驗(yàn)所得人參、紅參、黑參提取液用無(wú)血清RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋濃度為28.8 g/L、14.4 g/L、7.2 g/L、3.6 g/L、1.8 g/L。 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞,給藥組加預(yù)先配制好的各濃度藥物,置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。藥物作用結(jié)束后,每孔加30 μL(5 mg/mL)MTT,置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h后吸去孔內(nèi)上清液,每孔加入 150 μL DMSO,全自動(dòng)酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)570 nm檢測(cè)各孔吸光度值(A)。用以下公式求藥物對(duì)細(xì)胞的抑制率:抑制率=(正常組A—給藥組A)/正常組A×l00%。凋亡率檢測(cè)時(shí)細(xì)胞用藥物處理48 h,胰酶消化并洗滌,加入100 μL的Binding Buffer緩沖液吹打均勻。加入Annexin V-FITC染液5 μL混勻,避光反應(yīng)10 min,后加 PI染液5 μL,混勻避光5 min。 加入Binding Buffer緩沖液400 μL,輕輕混勻,1 h內(nèi)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS20.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理,檢測(cè)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()表示,各組均數(shù)間比較前先進(jìn)行正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn),若符合方差齊性,組間比較采用單因素方差分析,處理前后兩組間比較采用配對(duì)樣本t檢驗(yàn)方法進(jìn)行分析。選定P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同炮制方法對(duì)人參皂苷含量的影響 人參標(biāo)品用HPLC法測(cè)定峰面積,繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線,得到含量與濃度的函數(shù),R2值良好。由圖1和表2可知,HPLC法測(cè)定的人參不同炮制方法所得提取物主要有人參皂苷Rg1、Re、Rb1、Rg3,根據(jù)圖1中各峰面積及標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算可得表2,結(jié)果顯示在人參炮制過程中,人參總皂苷含量由0.56%下降到0.13%,稀有皂苷 Rg3 含量由 0.17% 增加到0.30%,人參總皂苷轉(zhuǎn)化為稀有皂苷Rg3。

圖1 不同炮制方法人參皂苷含量色譜圖

表2 不同炮制方法皂苷含量變化

2.2 3種提取液對(duì)肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用 與對(duì)照組比較,黑參組對(duì)肝癌細(xì)胞的抑制率明顯增加(P<0.05),高于紅參組和人參組,抑制率在藥物濃度為28.8 g/L時(shí)最高,濃度大于3.6 g/L時(shí)都有抑制作用,統(tǒng)計(jì)分析得黑參提取液的濃度—抑制率回歸方程 y=0.033 4x-0.068 9,R2=0.095 73,求得IC50=17.03 g/L。同時(shí)發(fā)現(xiàn)紅參提取液和人參提取液濃度低于28.8 g/L時(shí),對(duì)HepG2細(xì)胞幾乎沒有抑制作用(表3)。

表3 三種提取液對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的增值抑制作用(,n=6)

表3 三種提取液對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的增值抑制作用(,n=6)

?:與對(duì)照組比較,P<0.05;-:與對(duì)照組比較,沒有抑制作用

__________黑參組 紅參組 人參組_______________________________________________________________________OD值(抑制率/%)對(duì)照組 0 0.46 ±0.06 0.45 ±0.05 0.46 ±0.04給藥組 28.8 0.07 ±0.01(84.8)? 0.36 ±0.06(20.0)? 0.34 ±0.05(26.1)?14.4 0.21 ±0.06(54.3)? 0.46 ±0.06(-) 0.55 ±0.06(-)7.2 0.41 ±0.07(10.9) 0.51 ±0.02(-) 0.69 ±0.07(-)3.6 0.45 ±0.06(2.17) 0.58 ±0.06(-) 0.61 ±0.06(-)___________________________1.8________________________________________________________________________________________________________0.46_±0.08(-)_0.52_±0.07(-)_0.82_±0.08(-)組別 濃度(g/L)

2.3 3種提取液對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡率的影響 用Annexin V-FITC/PI雙染色法測(cè)定提取液對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡作用,與陰性對(duì)照組比較,黑參組顯著增加人肝癌細(xì)胞的晚期凋亡率和總凋亡率(P<0.05),且黑參組對(duì)HepG2細(xì)胞的晚期凋亡率要強(qiáng)于紅參組和人參組。紅參組對(duì)肝癌細(xì)胞的凋亡作用不如黑參組,但強(qiáng)于人參組,主要表現(xiàn)為增加了肝癌細(xì)胞的早期凋亡率(P<0.05),人參組對(duì)人肝癌細(xì)胞的凋亡作用不明顯。3種提取液對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡率降低順序?yàn)楹趨?紅參>人參(表4)。

表4 3種提取液對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡率影響

表4 3種提取液對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的凋亡率影響

a:與對(duì)照組早期凋亡率比較,P<0.05;b:與對(duì)照組中晚期凋亡率比較,P<0.05;c:與對(duì)照組總凋亡率比較,P<0.05

___組別 早期凋亡率/% 中晚期凋亡率/% 總凋亡率/%對(duì)照組 1.1 ±0.20 2.0 ±0.32 3.1 ±0.50黑參組 24.6 ±6.68 44.8 ±3.38b 69.4 ±8.8c紅參組 31.2 ±3.74a 20.0 ±1.95b 51.3 ±4.1c__人參組_________9.27 ±5.27_____________________________________7.63_±6.35_13.6_±5.6

3 討論

HPLC法是定性定量分析復(fù)雜化合物的常用方法,本研究通過此法分析了黑參液中總皂苷和稀有皂苷含量的變化,相較于人參和紅參,黑參中稀有皂苷的含量明顯增加,有研究表明,稀有皂苷是人參中的主要抗腫瘤成分,Wang[7]研究表明,稀有皂苷Rg5保護(hù)小鼠APAP引起的肝毒性;Shin-jung等[8]發(fā)現(xiàn)稀有皂苷Rg5通過調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白誘導(dǎo)乳腺癌細(xì)胞凋亡。Dong-Gun等[9]研究發(fā)現(xiàn),人參稀有皂苷Rg3與其他化療藥物在抗腫瘤方面有協(xié)同作用。本試驗(yàn)通過MTT法和流式細(xì)胞術(shù)比較研究明顯看出黑參的抗腫瘤活性強(qiáng)于紅參和人參,我們有理由懷疑黑參的抗腫瘤活性與其含有的稀有皂苷含量變化有關(guān),在抗腫瘤研究方面可以向人參稀有皂苷方面繼續(xù)探索,為人參抗腫瘤藥物的研究提供了可行思路。

有的研究證明了黑參具有較強(qiáng)的抗氧化能力,也正因?yàn)槿绱似渌幮б獜?qiáng)于普通人參,Bak等[10]發(fā)現(xiàn),黑參通過誘導(dǎo)抗氧化酶活性和抑制MAPK通路來(lái)保護(hù)HepG2細(xì)胞免受氧化應(yīng)激。Hu[11]研究證明,黑參抑制小鼠體內(nèi)肝毒性主要與其抗氧化、抗炎、抗凋亡和反硝化有關(guān)。Chen[12]發(fā)現(xiàn)加味黑參可以提高H22荷瘤小鼠的免疫功能,誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。通過本次研究發(fā)現(xiàn),黑參的抗氧化作用以及黑參中稀有皂苷抗腫瘤的機(jī)制還有待探討,這也成為本課題組今后的研究方向,可見黑參的藥用價(jià)值開發(fā)仍有很長(zhǎng)的路要走。

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