中藥抗大腸桿菌O157:H7的篩選及其在體外瘤胃發(fā)酵中的應用

王東升,田曉娟,張國華,黃江麗,何 力,計少石,圣 平,張志紅,丁建南

(江西省科學院生物資源研究所,江西 南昌 330096)

大腸桿菌O157:H7是一種具有嚴重危害的食源性腸道致病菌,可以引起人出血性結腸炎、溶血性尿毒綜合征等疾病,所以又稱腸出血性大腸桿菌。該菌在加拿大、美國感染流行最多,其感染具有強烈的致病性、致死性以及抗生素治療可能會加劇病情等特點,目前已成為全球性的公共衛(wèi)生問題。近些年來,在國內肉制品中屢屢檢出E.coliO157:H7,江蘇省徐州市2006-2009年對熟肉制品、生肉、蔬菜沙拉等產品進行檢測,E.coliO157:H7的檢出率為1.21%[1],且主要集中在生肉和蔬菜沙拉上,說明食用生肉仍是其感染的主要途徑。因此,控制動物感染E.coliO157:H7,是有效防控和解除該菌對人們健康威脅的關鍵。

由于抗生素的廣泛濫用,導致出現了大量的耐藥菌株,給人類、動物及環(huán)境帶來了巨大的危害,在歐盟已經禁止抗生素作為飼料添加劑來使用,我國也逐漸禁止。因此,研究和開發(fā)利用中藥控制E.coli O157:H7對解決抗生素禁用問題是一個重要的途徑。本研究從澤漆、黃芪、黃連等11種中藥的水提液和醇提液中篩選對E.coli O157:H7有抑菌作用的,然后抑菌作用強的幾種提取液做體外瘤胃發(fā)酵抑菌試驗,以便為這幾種中藥提取液作為反芻動物飼料添加劑的應用及發(fā)展提供一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料 澤漆、黃芪、黃連、虎杖、肉桂、丁香、厚撲、黃芩、石斛、白芍、夏枯草;Escherichia coli O157:H7(菌株編號:CICC21530);體外瘤胃發(fā)酵底物:稻草粉、玉米粉和黃豆粉按照2∶1∶0.3的比例配制。

1.2 中藥提取液制備 將中藥打粉過40目篩后分別用水提法、醇提法進行提取。

1.2.1 水提法 取中藥粉100 g,加入1 000 mL蒸餾水,在60℃的水浴中放置10 h(期間多次搖動),10 000 r/min離心10 min,取上清,上清經60℃旋轉蒸發(fā)濃縮至100 mL(相當生藥量1 g/mL),冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 醇提法 取中藥粉100 g,加入1 000 mL無水乙醇,操作方法與水提法相同。

1.3 中藥提取液抑菌試驗 E.coli O157:H7在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)至濃度106CFU/mL,取150 μL菌液涂布于LB固體培養(yǎng)基,放上滅菌牛津杯,加入100 μL中藥提取液(處理組)、滅菌水(無水乙醇,陰性對照)或青霉素(陽性對照),過夜培養(yǎng),觀察并測量抑菌圈大小。

1.4 體外瘤胃發(fā)酵試驗 試驗設對照組和處理組,每組4個重復,每個重復加入100 μL濃度為106CFU/mL的E.coli O157:H7,中藥提取液添加量均為500 μL。牛瘤胃液從裝有永久性瘤胃瘺管的瘤胃中采集,采用本研究室改進的體外瘤胃模擬裝置培養(yǎng)24 h后,取培養(yǎng)物備用[2]。

1.5 體外瘤胃發(fā)酵物總DNA提取 體外瘤胃培養(yǎng)物12 000 r/min(4℃)離心10 min,棄上清,沉淀用OMEGA糞便DNA提取試劑盒提取微生物總DNA,經1%瓊脂糖凝膠電泳,檢測 OD260/OD280比值。

1.6 相對定量PCR 以提取的總DNA為模板,采用RT-PCR方法測定體外瘤胃發(fā)酵過程中中藥提取液對 E.coli O157:H7的抑制效果,以細菌16S rDNA為參照基因,引物參照Denman等[3],選擇E.coli O157:H7的特異性基因rfbE為檢測靶基因,引物參照[4],引物序列見表1,反應條件為:95℃預變性10 s;95℃變性5 s,60℃退火和延伸40 s,共40個循環(huán)。

用比較Ct值[5]來分析體外瘤胃發(fā)酵中添加和未添加中藥提取液的情況下rfbE基因相對16S rDNA的量。樣品擴增的rfbE基因和16S rDNA基因的 Ct值,用公式 RATE=2-ΔΔCt計算 rfbE 基因相對16S rDNA的量。采用SPSS 23統計軟件上的單因素方差分析(ANOVA)和Duncan多重比較對數據進行統計學分析。

表1 相對定量PCR引物序列

1.7 半數致死量(LD50)的測定 使用大鼠進行急性經口毒性(LD50)試驗,將40只大鼠隨機分為5組,每組8只,雌雄各半,用不同濃度梯度的提取液灌胃,記錄大鼠死亡數,用SPSS軟件計算LD50值[6]。

2 結果與分析

2.1 中藥提取液抑菌試驗結果 中藥的水提液和醇提液對E.coli O157:H7的牛津杯法抑菌試驗結果如表2所示,澤漆、黃芪、黃連、虎杖、石斛、白芍、夏枯草等7種中藥的水提液和醇提液都沒有抑菌圈,對E.coli O157:H7沒有抑制作用;厚撲的醇提液抑菌圈1.83 cm,水提液沒有抑菌圈,表明厚撲醇提液有抑制E.coli O157:H7作用,而水提液沒有;肉桂和黃芩相似,水提液的抑菌圈分別為0.66 cm和0.74 cm、醇提液的抑菌圈分別為2.89 cm和1.31 cm,說明肉桂和黃芩的水提液和醇提液對E.coli O157:H7都有抑制作用,但是它們的醇提液比水提液的抑菌作用強;丁香的水提液和醇提液的抑菌圈分別是2.37 cm和0.34 cm,可見它們都對E.coli O157:H7有抑制作用,但其水提液比醇提液抑菌作用強。根據抑菌圈直徑大小分析,4種提取液對E.coli O157:H7存在有效抑制作用,強弱順序為:肉桂醇提液>丁香水提液>厚撲醇提液>黃芩醇提液。

表2 中藥提取液對E.coli O157:H7的抑菌效果,n=3)

表2 中藥提取液對E.coli O157:H7的抑菌效果,n=3)

-:無結果;+:輕度抑菌;++:中度抑菌;+++:高度抑菌。抑菌圈直徑為處理抑菌圈直徑減去陰性對照抑菌圈直徑

_______提取液 抑菌圈直徑/cm 抑菌效果水提液澤漆 - -黃芪 - -黃連 - -虎杖 - -肉桂 0.66±0.06 +丁香 2.37±0.13 +++厚撲 - -黃芩 0.74±0.04 +石斛 - -白芍 - -____________夏枯草__________________________________________________________-_-澤漆 - -醇提液黃芪 - -黃連 - -虎杖 - -肉桂 2.89±0.10 +++丁香 0.34±0.04 +厚撲 1.83±0.07 ++黃芩 1.31±0.11 ++石斛 - -白芍 - -____________夏枯草__________________________________________________________-_-水--陰性對照_________________________________________________________乙醇_0.11±0.01_+_陽性對照_____青霉素___________________________________________3.06±0.12_+_+_+

2.2 體外瘤胃發(fā)酵物總DNA提取結果 通過OMEGA糞便DNA提取試劑盒提取體外瘤胃發(fā)酵內容物的總DNA,DNA片段完整,并且OD260/OD280比值在1.81至1.85之間,說明DNA比較純。

2.3 相對定量PCR結果 本研究應用RT-PCR測定體外瘤胃發(fā)酵中E.coli O157:H7的rfbE基因相對總DNA中16S rDNA的量(2^-ΔΔCt),用來說明中藥提取液在體外瘤胃發(fā)酵中對E.coli O157:H7的抑制情況。如表3所示,體外瘤胃發(fā)酵中添加厚樸醇提液,2^-ΔΔCt值為0.82,與對照的1.01 相比,沒有顯著差異(P>0.05);丁香水提液(0.19)、肉桂醇提液(0.10)和黃芩醇提液(0.42)的 2^-ΔΔCt值顯著低于厚樸醇提液和對照(P<0.05),丁香水提液和肉桂醇提液的2^-ΔΔCt值也都顯著低于黃芩醇提液(P<0.05),但丁香水提液和肉桂醇提液之間的值沒有顯著差異(P>0.05)。值的大小也表明各實驗組中E.coli O157:H7相對量的多少。因此,在體外瘤胃發(fā)酵中,抑制E.coli O157:H7的強弱順序為:肉桂醇提液>丁香水提液>黃芩醇提液>厚樸醇提液。

表3 E.coli O157:H7的rfbE基因的RT-PCR結果

2.4 半數致死量(LD50)測定結果 經試驗,肉桂醇提液、丁香水提液、黃芩醇提液和厚樸醇提液對雌雄大鼠經口LD50均大于15 000 mg/kg體重。根據衛(wèi)計委GB 15193.3-2014號公告的急性毒性(LD50)劑量分級標準,大于15 000 mg/kg體重為無毒,所以,肉桂醇提液、丁香水提液、黃芩醇提液和厚樸醇提液均屬于無毒物。

3 討論與小結

3.1 中藥提取液抑菌試驗結果 現代分析和醫(yī)理實驗證明,中藥存在一些成分對金黃色葡萄球菌、傷寒桿菌、大腸桿菌等均有明顯的抑制作用[7],一般來說,這些中藥抑菌都是廣譜型的。張顯忠等研究表明[8],丁香醇提液比水提液抑制的作用更強,這和本研究的結果相反,可能是張顯忠等人丁香水提液是采用水煮法的原因,因為該法需要加熱到100℃,致使丁香水提液中抑菌的活性物質失去活性。本研究結果顯示,黃芩水提液和醇提液對E.coli O157:H7都有抑制作用,這與張莉等研究結果一樣[9]。陳惠等[10]研究結果表明,肉桂醇提液抑菌能力強于肉桂水提液,這個結果也與本研究結果一致,不同的是本研究的結果是肉桂提取液抑菌能力強于丁香提取液,而陳惠等研究結果是丁香提取液抑菌能力強于肉桂提取液,這個不同結果應該是這兩個研究中肉桂和丁香提取液制備過程中溫度和乙醇濃度不同所致。本研究中,厚樸醇提液對E.coli O157:H7有中等抑菌效果,這與吳維萍的研究結果一致[11]。中藥提取液的牛津杯抑菌試驗結果表明,中藥活性成分采用水提取和醇提取對E.coli O157:H7的抑制有完全不同的效果:醇提法更有效的作用極可能是由于提取液中除了水溶性的成分還有水不溶的酯類等活性成分[8]或只含有酯類活性成分,水提法更有效的作用極可能是由于提取液中抑菌活性成分只溶于水,而不易溶于乙醇。因為中藥提取方法或工藝的不同,也會導致提取液的抑菌效果不同,所以對不同的中藥應根據其所含活性成分的不同及目標產物的不同而選取最優(yōu)的提取工藝,以達到最好的提取效果[9]。

3.2 體外瘤胃發(fā)酵物總DNA提取結果 體外瘤胃發(fā)酵內容物與土壤、沉積物不同,成分十分復雜,平常的DNA提取方法所得到的DNA通常不純,含有色素、蛋白、RNA等雜質,因而影響后續(xù)的分子生物學實驗。由于體外瘤胃發(fā)酵內容物與糞便相似,因此本研究選擇OMEGA糞便DNA提取試劑盒提取體外瘤胃發(fā)酵物總DNA。結果,不論從DNA瓊脂糖電泳圖譜上看,還是從DNA的OD260/OD280比值上看,所提取的DNA質量都達到了后續(xù)分子生物學實驗的要求。

3.3 相對定量PCR結果 通過體外瘤胃發(fā)酵和相對定量PCR實驗來初步檢驗肉桂醇提液、丁香水提液、厚撲醇提液、黃芩醇提液在實際應用中對E.coli O157:H7的抑制效果,用來評估這些中藥提取液抑菌的應用前景。當前,有一些研究檢測 E.coli O157:H7的報道,基本都選擇E.coli O157:H7的O157抗原基因rfbE作為檢測E.coli O157:H7的檢測靶基因,該基因具有極強的特異性,其編碼大腸桿菌脂多糖(LPS)[4,12]。

在體外瘤胃發(fā)酵試驗中,4種中藥提取液對E.coli O157:H7的抑制效果與牛津杯法抑菌試驗的結果一致。肉桂醇提液和丁香水提液對E.coli O157:H7抑制能力最強,但是仍然能夠檢測到 E.coli O157:H7的存在,說明提取液添加的量不足以殺死E.coli O157:H7,只是抑制了E.coli O157:H7的生長或過快生長。黃芩醇提液和厚樸醇提液對E.coli O157:H7抑制能力就要弱得多,其添加的體外瘤胃發(fā)酵中,依然有大量的E.coli O157:H7繁殖。如表3所示,肉桂醇提液(8.71)、丁香水提液(8.70)、黃芩醇提液(8.21)的16S rDNA Ct值顯著高于對照(7.45),充分說明它們對體外瘤胃發(fā)酵中微生物的抑制如抗生素一樣具有廣譜性。

3.4 半數致死量(LD50)的測定結果 測定半數致死量能比較準確地反映出提取液的毒性大小:半數致死量與毒性成反比,即致死量越小,毒性越大;致死量越大,毒性越小[13]。本研究的肉桂醇提液、丁香水提液、黃芩醇提液和厚樸醇提液對大鼠經口LD50測定結果均大于15 000 mg/kg體重,可以確定這4種提取液均為無毒物,這個結果也說明這4種提取液作為反芻動物飼料添加劑,能夠起到對病源菌的抑制作用,而對動物本身沒有傷害。

研究結果表明,在供試的11種中藥中,肉桂、丁香、厚撲和黃芩提取液對E.coli O157:H7有較強的抑制效果,并且無毒,其中丁香采用水提取法抑菌效果更佳,肉桂、黃芩和厚樸采用醇提取法抑菌效果更佳;肉桂醇提液和丁香水提液具有代替抗生素作為反芻動物飼料添加劑的應用前景。

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