山西省奶牛乳腺炎流行病學調(diào)查研究

武守艷,董春光,韓文儒,楊麗華,劉文俊,陳劍波,韓一超

(山西省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所,山西 太原 030032)

近年來,奶業(yè)已成為我國快速發(fā)展的新興產(chǎn)業(yè),隨著奶牛業(yè)的飛速發(fā)展,飼養(yǎng)數(shù)量和飼養(yǎng)規(guī)模急劇加大,奶牛疾病的防治也給奶牛業(yè)帶來了巨大的壓力,且疾病的種類和病原呈現(xiàn)出多樣性的變化。奶牛乳腺炎是奶牛常見和多發(fā)病之一,一直以來是困擾奶牛業(yè)的一大難題,它不僅造成乳品營養(yǎng)成分降低、質(zhì)量下降、而且影響食品衛(wèi)生,危害人體健康[1]。盡管在國內(nèi)外一直是人們研究的熱點、難點,但仍然給奶牛業(yè)造成了很大的經(jīng)濟損失。據(jù)文獻報道,奶牛乳腺炎主要由多種非特定病原微生物引起,不同地區(qū)不同季節(jié)奶牛乳腺炎致病菌的分布和種類均有差異[2]。本研究在2015-2016年通過對山西省榆次、清徐、祁縣、太谷、山陰、永濟及太原郊區(qū)奶牛場1 300頭奶牛進行乳腺炎流行病學調(diào)查,采集奶樣進行病原的分離、培養(yǎng)、鑒定及藥敏試驗研究,為當?shù)啬膛Ｈ橄傺椎木C合防治提供理論基礎(chǔ)和有效的臨床指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基 沙保勞瓊脂、鮮血瓊脂、麥康凱瓊脂、S.S.、瓊脂、普通瓊脂、營養(yǎng)肉湯、科瑪加培養(yǎng)基,均購自遐邇商貿(mào)有限公司。

1.1.2 藥品與試劑 藥敏紙片:頭孢西丁、頭孢克洛、阿米卡星、環(huán)丙沙星、諾氟沙星、頭孢曲松、頭孢哌酮、阿莫西林、氨曲南、亞胺培南、頭孢唑啉、利奈唑胺。5氟胞嘧啶 、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑、兩性霉素,均購自遐邇商貿(mào)有限公司;CMT試劑,購自太原天和試劑有限公司。

1.1.3 儀器 法國梅里埃VITEK-2全自動微生物鑒定藥敏儀。

1.1.4 試驗動物 選擇20只ICR小鼠,級別為清潔級,許可證號為scxk(晉)2015—0001為試驗動物,購自山西醫(yī)科大學實驗動物室。

1.2 方法

1.2.1 奶樣采集 奶樣采集于山西省榆次、清徐、祁縣、太谷、山陰、永濟及太原郊區(qū)奶牛場,共采集樣品120份,其中采自確診為臨床型乳腺炎奶牛的患病乳區(qū)的奶樣65份,用CMT試劑檢測為隱性乳腺炎的奶樣55份。采樣時先用溫水洗凈乳頭,再用0.1%新潔爾滅清洗整個乳房,最后用75%酒精擦拭乳頭,待酒精干后棄去前三把乳汁,然后在每個乳區(qū)無菌擠出奶樣約10 mL放入滅菌試管中,標明牛號、乳室、日期,冰盒保存立即送回實驗室檢測(不超過4 h)。

1.2.2 病原的分離培養(yǎng) 將樣品搖勻后,取5 mL置于滅菌離心管中以3 000 r/min離心10 min,棄去離心管中的上層液體,留取底部沉淀物,無菌操作吸取沉淀物0.1 mL,分別接種于鮮血瓊脂、麥康凱瓊脂、S.S.、瓊脂,普通營養(yǎng)瓊脂,營養(yǎng)肉湯中,37 ℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24 h,觀察培養(yǎng)基上菌落生長情況和特征,挑取菌落進行涂片,革蘭染色,鏡檢,根據(jù)菌落特征,溶血情況。染色特性及菌體形態(tài),初步判定細菌類屬,并將其進一步純化培養(yǎng)。同時將營養(yǎng)肉湯過夜增菌后,接種于沙堡勞瓊脂培養(yǎng)基,普通瓊脂培養(yǎng)基和科瑪加培養(yǎng)基,37℃培養(yǎng)48 h后,進行菌落形態(tài)觀察,并用革蘭染色液染色鏡檢細菌形態(tài)、大小。

1.2.3 病原菌鑒定 按儀器操作說明書使用VITEK-2全自動微生物鑒定藥敏儀,進行生化分析,從而鑒定菌種。

1.2.4 藥敏試驗 取1.1.2備好的藥敏紙片,選取典型的分離菌株,按照紙片擴散法和MIC(最小抑菌濃度)法對分離的菌株進行藥物敏感性試驗,參考世界臨床實驗室標準委員會(NCCLS)推薦的紙片擴散標準和MIC(最小抑菌濃度)標準分別對細菌和真菌藥敏試驗判定結(jié)果。

1.2.5 致病性試驗 用無菌注射器抽取典型細菌經(jīng)18 h的肉湯培養(yǎng)液,腹腔接種小鼠0.5 mL/只,每種菌接種4只,同時,設(shè)無菌生理鹽水空白對照,觀察72 h并記錄細菌對小鼠的致病性,將死亡小鼠的肝、脾、腎等臟器進行細菌分離鑒定。

2 結(jié)果

2.1 病原菌的分離培養(yǎng),鑒定結(jié)果 見表1。從表1可以看出,120份樣品共分離出8種402株病原菌,經(jīng)鑒定其中大腸桿菌78株(19.4%)、大腸桿菌ESBL陽性株18株(4.5%)、葡萄球菌88株(21.9%)、鏈球菌95株(23.6%)、糞腸球菌15株(3.7%)、藤黃微球菌25株(6.2)、洛菲不動桿菌株16(4.0%)、小型原藻40株(10.0%)、克柔念珠菌45株(11.2%)。

2.2 藥敏試驗結(jié)果 見表2、3和4。

表1 病原菌分離鑒定結(jié)果

表2 紙片擴散法細菌藥敏試驗判斷標準 (mm)

表3 真菌最小抑菌(MIC)濃度法藥敏試驗判定標準(mg/L)

從表4可以看出,大腸桿菌除對阿莫西林中介(中度敏感)外,對其他藥物均敏感;大腸桿菌ESBL+(耐β內(nèi)酰胺酶)對頭孢類、阿莫西林、氨曲南均耐藥,對亞胺培南、利奈唑胺敏感;鏈球菌除對頭孢唑啉耐藥,對阿莫西林、利奈唑胺、環(huán)丙沙星、阿米卡星中介(中度敏感)外,對其他藥物均敏感;葡萄球菌對阿莫西林、頭孢唑啉中介(中度敏感),對其他藥物均敏感。

表4 主要致病菌藥敏試驗結(jié)果 (mm)

表5 真菌MIC(最低抑菌濃度)法藥敏試驗結(jié)果(mg/L)

從表5可以看出,小型原藻對5氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑、伏立康唑均耐藥,對兩性霉素敏感;克柔念珠菌對5氟胞嘧啶、氟康唑、伊曲康唑均耐藥,對伏立康唑、兩性霉素敏感。

2.3 致病性試驗結(jié)果 將各種細菌及真菌菌液注射小鼠腹腔后,將死亡小鼠臟器進行病原菌的分離培養(yǎng)及鑒定,結(jié)果與接種菌完全相同。

3 討論

3.1 本試驗中共采集樣品120份,分離出8種402株病原菌,經(jīng)鑒定其中大腸桿菌78株(19.4%)大腸桿菌ESBL陽性株18株(4.5%),葡萄球菌88株(21.9%)、鏈球菌95株(23.6%)、糞腸球菌15株(3.7%)、藤黃微球菌25株(6.2)、洛菲不動桿菌16株(4.0%)、小型原藻40株(10.0%)、克柔念珠菌45株(11.2%)。從試驗結(jié)果可以看出,主要病原菌為大腸桿菌、葡萄球菌、鏈球菌、小型原藻和克柔念珠菌。

3.2 藥敏試驗結(jié)果表明,大腸桿菌除對阿莫西林中介(中度敏感)外,對其他藥物均敏感;大腸桿菌ESBL陽性株(耐β內(nèi)酰胺酶)對頭孢類、阿莫西林、氨曲南均耐藥,對亞胺培南、利奈唑胺敏感;鏈球菌除對頭孢唑啉耐藥,對阿莫西林、利奈唑胺、環(huán)丙沙星、阿米卡星中介(中度敏感)外,對其他藥物均敏感;葡萄球菌對阿莫西林、頭孢唑啉中介(中度敏感),對其他藥物均敏感。小型原藻對兩性霉素敏感,克柔念珠菌對伏立康唑、兩性霉素均敏感。細菌對某種藥物耐藥性的出現(xiàn)與平時該藥的使用頻率高有關(guān),為了預(yù)防長期用一種藥物治療引起的病原菌的耐藥性,最好定期進行藥敏試驗。

3.3 據(jù)資料報道奶牛乳腺炎的致病菌是多種非特定病原微生物,而且奶牛乳腺炎的發(fā)生與環(huán)境、季節(jié)、營養(yǎng)、遺傳等多種因素有關(guān),但是多年以來,山西省奶牛乳腺炎的病原菌主要是大腸桿菌、鏈球菌和葡萄球菌[3],2015-2016年通過對山西省奶牛乳腺炎流行病學調(diào)查研究,發(fā)現(xiàn)近年來本省本病的病原有所變化,除常見細菌外,還增加了真菌的感染,同時ESBL陽性大腸桿菌(耐β內(nèi)酰胺酶)感染病例增加,這樣的結(jié)果在同類的研究中報道較少。

3.4 β內(nèi)酰胺酶能分解青霉素類、頭孢菌素類等β內(nèi)酰胺類抗生素,使這些類抗生素對細菌無效或使細菌對這些藥物耐藥。ESBL陽性大腸桿菌致病菌病例的增加給奶牛乳腺炎的治療造成很大的困難,據(jù)人醫(yī)方面的文獻報道,20世紀90年代產(chǎn)β內(nèi)酰胺酶腸桿菌愈演愈烈,而β內(nèi)酰胺酶也由普通酶進展至廣譜酶(ESBL),青霉素類、頭孢菌素第1代的過度使用導(dǎo)致產(chǎn)ESBL菌株出現(xiàn)[4],筆者認為動物方面的情況與人醫(yī)方面相同,近年來,養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的大量濫用也是造成ESBL陽性大腸桿菌(耐β內(nèi)酰胺酶)病例增加的主要原因,因此,為了減少細菌耐藥,養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)限制青霉素類、頭孢菌素的濫用。

3.5 近年來山西省奶牛乳腺炎的病原從單一的細菌感染發(fā)展為真菌和ESBL陽性大腸桿菌感染,這一現(xiàn)象的出現(xiàn)筆者認為與當前奶牛養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的大量濫用有密切的關(guān)系,一方面抗生素的大量濫用造成了動物機體內(nèi)的菌群失調(diào),導(dǎo)致二重感染,這是真菌感染的一種可能,另一方面ESBL陽性大腸桿菌病例的增加與青霉素和頭孢菌素的過度使用有著密切關(guān)系。ESBL陽性大腸桿菌病例的出現(xiàn)增加了治療的難度和成本。碳青霉烯環(huán)的抗生素對ESBL陽性大腸桿菌感染病例有效,藥敏試驗中的亞胺培南為碳青霉烯環(huán)的抗生素,效果良好,但藥物成本較高,增加了該病的治療成本,加大了對養(yǎng)牛業(yè)的危害,更加降低了養(yǎng)牛業(yè)的經(jīng)濟效益。通過這次調(diào)研,提示我們在臨床治療奶牛乳腺炎時,應(yīng)該充分考慮到病原的多樣性,尤其真菌性乳腺炎,盲目使用抗生素治療,導(dǎo)致真菌性乳腺炎逐步惡化,且久治不愈,給奶牛場帶來較大的經(jīng)濟損失。盡量做到早發(fā)現(xiàn),早診斷,早治療,以減少經(jīng)濟損失[5]。

3.6 本研究中的病原菌糞腸球菌、藤黃微球菌、洛菲不動桿菌均屬條件性致病菌,奶牛養(yǎng)殖場的飼養(yǎng)管理不夠完善,奶牛機體抵抗力低下這些條件性致病菌就會引起發(fā)病。

參考文獻:

[1] 王春璈.奶牛場獸醫(yī)師手冊[M].北京:金盾出版社,2008.

[2] 齊長明,奶牛疾病學[M].北京:中國農(nóng)業(yè)科學技術(shù)出版社,2006:432.

[3] 武守艷,韓一超,陳劍波,等.山西省奶牛乳腺炎病原菌調(diào)查研究[J].中國奶牛,2013,35(16):28-30.

[4] 王小蘭,林立中,夏先考,等.ESBL陽性大腸埃希菌AmpC酶的檢測及其耐藥分析[J].醫(yī)學臨床研究,2006,23(12):1 930-1 934.

[5] 孫英峰,王秀珍,李秀麗,等.奶牛真菌性乳房炎病原菌的分離鑒定及其致病性研究[J].中國奶牛,2009,31(6):33-35.