河南省42株奶牛臨床型乳房炎病原菌的分子鑒定及藥敏試驗

皇甫和平,潘昊純,石冬梅,王 軍,宋予震,許文博,史靜柯,李聰聰,王林康

(河南牧業(yè)經(jīng)濟學院動物醫(yī)學院,河南 鄭州 450046)

奶牛乳房炎是由于病原菌侵入奶牛的乳腺組織,引起奶牛的乳房發(fā)生炎癥。該病在個體養(yǎng)殖戶、小型和大型奶牛養(yǎng)殖場均經(jīng)常發(fā)生,病牛的乳品質(zhì)和產(chǎn)奶量均降低,這不僅阻礙乳品經(jīng)濟產(chǎn)業(yè)的發(fā)展,還影響人類社會公共衛(wèi)生事業(yè)以及食品安全,抑制著奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展。目前,對于奶牛乳房炎的防治主要使用抗生素,但長期使用抗生素,會使病原菌產(chǎn)生不同程度的耐藥性。據(jù)流行病學調(diào)查報告顯示,引起奶牛乳房炎的病原菌有150余種[1],但臨床上較常見的有20多種,其中金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、鏈球菌是主要病原菌,三者可占到90%之多[2],不同的地區(qū)不同的細菌所占的比例有一定的差異。因此及時掌握各自地區(qū)奶牛乳房炎病原菌的種類和耐藥情況是非常重要的,不僅可以提高奶牛生產(chǎn)性能、減少經(jīng)濟損失,還對促進本省部分地區(qū)奶業(yè)持續(xù)健康發(fā)展具有極其重要的意義。

傳統(tǒng)的細菌分離鑒定過程不僅繁瑣復雜,而且耗時,16S rRNA基因序列分析可以實現(xiàn)對病原菌進行快速、準確地分類和鑒定[3]。課題組從鄭州、焦作的3家奶牛場采集臨床型乳房炎奶樣并進行病原菌的分離培養(yǎng),對16S rRNA基因進行了PCR擴增,通過藥敏試驗進行耐藥性分析,為臨床合理用藥和改善乳房炎預防措施提供參考。

1 材料

1.1 培養(yǎng)基與試劑 營養(yǎng)肉湯,購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司;鮮血瓊脂平板、DL-2 000 DNA Marker,購自寶生物工程(大連)有限公司、4S Green核酸染料,購自上海生工生物工程技術服務有限公司。

1.2 儀器 900系列超低溫冰箱由美國賽默飛世爾科技有限公司生產(chǎn);ETC-811 PCR儀由北京東勝創(chuàng)新生物科技有限公司生產(chǎn);Universal HoodⅡ凝膠成像系統(tǒng)由美國伯樂(BIO-RAD)公司生產(chǎn)。

1.3 藥敏紙片 紅霉素(E15)、頭孢噻肟(CTX30)、環(huán)丙沙星(CIP5)、克林霉素(DA2)、慶大霉素(CN10)、左氧氟沙星(LEV5)、萬古霉素(VA30)、四環(huán)素(TE30)、壯觀霉素(SH100)、頭孢曲松(CRO30)、氨芐西林(AMP10)、阿齊紅霉素(AZM15)、阿米卡星(AK30)、氧氟沙星(OFX5)、復方新諾明(SXT25)、妥布霉素(TOB10)、氯霉素(C30),藥敏片由英國OXOID公司生產(chǎn)。

1.4 引物 參考Weisburg[4]的方法合成16S rRNA基因通用引物,引物序列為:16S-F(5′-CCG AAT TCG TCG ACA ACA GAG TTT GAT CATGGCTCAG-3′)、16S-R(5′-CCC GGGATCCAAGCT TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′)。

2 方法

2.1 奶樣采集 選擇鄭州的2家及焦作的1家奶牛場進行采樣,共計采集臨床型乳房炎病乳47份,奶樣采集后2 h內(nèi)送去實驗室進行微生物的培養(yǎng),或凍存于-80℃冰箱備用。

2.2 細菌的分離與培養(yǎng) 將奶樣搖勻,以無菌操作涂布于血平板,37℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h,挑選可疑的典型菌落涂片、革蘭染色、鏡檢。然后將典型菌落再次接種于鮮血瓊脂平板進行純化培養(yǎng),18～24 h后鏡檢,如果細菌純凈則接種于營養(yǎng)肉湯,37℃,180 r/min震蕩培養(yǎng)18 h,用于細菌DNA的提取。

2.3 DNA提取 取1 mL細菌肉湯于1.5 mL離心管中,10 000 r/min離心5 min棄掉上清液,加入600 μL TE緩沖液,100℃沸水浴10 min,立即冰浴2 min,12 000 r/min離心10 min。上清液即為DNA溶液,-20℃?zhèn)溆没蛘吡⒓词褂谩?/p>

2.4 16S rRNA PCR16S rRNA PCR反應體系(25 μL):10 × Ex Taq Buffer 2.5 μL,Ex Taq酶 0.125 μL,Mg2+2 μL,dNTP 2 μL,模板 DNA 1 μL,16S rRNA-F 1μL,16S rRNA-R 1μL,ddH2O 15.375 μL。反應條件:94℃預變性30 s;98℃變性10 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,30個循環(huán);72℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠在1×TAE電泳液中電泳,用4S Green Nucle Acid染色,在凝膠成像系統(tǒng)中觀察PCR結果。

2.5 DNA測序鑒定 電泳檢測后的PCR產(chǎn)物,由上海生工生物工程技術服務有限公司測序,并將測序結果通過NCBI在線軟件BLAST進行比較分析。

2.6 藥敏試驗 選取17種藥敏紙片,根據(jù)美國臨床和實驗室標準協(xié)會(CLSI)抗菌藥物敏感性試驗標準(M100-S23),通過抑菌圈的大小判定細菌對藥物的耐藥性與敏感情況[5]。

3 結果與分析

3.1 奶牛臨床型乳房炎病原菌的分離結果 47份臨床型奶牛乳房炎乳樣共分離出細菌47株,鑒定出42株,其中鄭州的2家奶牛場34株,焦作的1家奶牛場8株。根據(jù)細菌的分離培養(yǎng),菌落形態(tài),革蘭染色鏡檢等特性,可初步判定分離細菌中主要有革蘭陰性桿菌18株、革蘭陽性桿菌14株、球菌9株、真菌1株等。

3.2 16S rRNA基因PCR結果 對分離的47株菌提取基因組DNA,擴增16S rRNA基因,結果如圖1,擴增得到約1 600 bp的目的條帶。

圖1 部分樣品16S rRNA擴增結果

3.3 16S rRNA方法測序分析 在NCBI上對所得的序列進行BLAST比對,結合傳統(tǒng)的微生物鑒定法,對鄭州、焦作地區(qū)的47份乳房炎奶樣,共分離得到17種42株細菌,由表1可知,本試驗檢出的42株細菌中,鄭州的2家奶牛場分離鑒定出14種34株菌,環(huán)境性病原菌12種28株,所占比例最多(82.4%),以大腸桿菌、克雷伯氏菌為主,分別占20.6%、17.6%;傳染性病原菌只有2株金黃色葡萄球菌,占5.9%。焦作的1家奶牛場分離鑒定的病原菌只有4種8株,環(huán)境性病原微生物4株,占50.0%,未分離鑒定出傳染性病原微生物。鄭州和焦作3家奶牛場的環(huán)境性病原菌分離率高,說明兩市的3家奶牛臨床型乳房炎與環(huán)境性病原菌密切相關,應加強環(huán)境衛(wèi)生管理,給奶牛提供一個舒適的環(huán)境。鄭州的2家奶牛場分離得到的傳染性病原菌比例、環(huán)境性病原菌比例均高于焦作,鄭州的2家奶牛場更應該關注環(huán)境衛(wèi)生的改善。焦作臨床型乳房炎奶樣沒有分離鑒定出傳染性病原菌,可能該市的1家奶牛場對致病菌采取了較好的防治措施。

表1 分離菌株種類

3.4 藥敏試驗結果 分離菌株中的26株致病菌的耐藥結果如表2,鄭州的2家奶牛場的23株致病菌對11類藥物均產(chǎn)生不同程度的耐藥,耐藥率4.35%～56.52%,對喹諾酮類、頭孢類、復方新諾明、氨芐西林、四環(huán)素、氯霉素、紅霉素的耐藥率為8.70%～56.52%,對氨芐西林的耐藥率最高,高達56.52%。焦作的1家奶牛場的3株致病菌只對復方新諾明、氨芐西林、四環(huán)素、氯霉素4種抗生素產(chǎn)生耐藥性,耐藥率33.33%～100%,對其余7類藥物敏感。鄭州和焦作兩市的3家奶牛場致病菌對復方新諾明、氨芐西林、四環(huán)素、氯霉素這4種藥物產(chǎn)生嚴重的耐藥性,耐藥率33.33%～100%。鄭州奶牛場耐藥情況比焦作奶牛場耐藥情況嚴重。

26株致病菌的多重耐藥結果如表3,分離的菌株產(chǎn)生了較為嚴重的多重耐藥,26株致病菌有15株產(chǎn)生了多重耐藥,占57.69%。其中,最嚴重的是1株大腸桿菌耐11種抗生素(3.85%),耐6種抗生素的菌有2株(7.69%),耐5種抗生素的菌有5株(19.23%),耐4種抗生素的菌有5株(19.23%),耐3種抗生素的菌有2株(7.69%)。

4 討論

本次研究共計分離鑒定出17種42株細菌,說明河南省鄭州、焦作兩市的3家奶牛場臨床型乳房炎的病原菌種類繁多,尤其是鄭州的2家奶牛場,環(huán)境性致病菌數(shù)量均多于焦作,提醒相應奶牛場注意改善奶牛生活環(huán)境,加強管理。在分離的病原菌中,大腸桿菌,是環(huán)境性致病菌;克雷伯氏菌、表皮葡萄球菌、粘質(zhì)沙雷菌是條件致病菌,對人有較強的致病性;糞腸球菌不僅可以誘發(fā)心內(nèi)膜炎,還可以感染尿路和傷口;金黃色葡萄球菌可以引起人和動物的局部化膿性感染,其與蠟樣芽孢桿菌均可以引起人類食物中毒;除此之外,還檢測出普通變形桿菌、豬葡萄球菌、模仿葡萄球菌、氣單胞菌,這些菌株均具有致病性。

表2 分離菌株的耐藥結果

表3 26株菌的多重耐藥率

目前,對于奶牛乳房炎的防治還是以使用抗生素為主,但大量使用抗生素,會使牛乳中殘留的抗生素超標,人類長期食用含抗生素的乳品,會危害人類的身體健康。分離菌株中的26株致病菌的耐藥結果如表2,鄭州2家奶牛場分離出的23株致病菌對11類藥物均產(chǎn)生不同程度的耐藥,耐藥率4.35%～56.52%。焦作1家奶牛場分離出的3株致病菌只對復方新諾明、氨芐西林、四環(huán)素、氯霉素4種藥物產(chǎn)生耐藥性,耐藥率33.33%～100%,對其余7類藥物敏感。鄭州的2家奶牛場耐藥情況比焦作嚴重,這可能與牛場在發(fā)生乳房炎后長期固定使用這幾種抗生素有關。一株病原菌同時對3種及3種以上的藥物產(chǎn)生耐藥為多重耐藥。26株致病菌有15株產(chǎn)生多重耐藥,多重耐藥結果如表3,占57.69%。其中,最嚴重的是1株大腸桿菌耐11種抗生素(3.85%)。因此,建議該牛場定期對臨床型乳房炎奶樣進行細菌的分離鑒定、耐藥性分析及合理交替使用抗生素,以便更好地防治乳房炎。本次試驗分離的金黃色葡萄球菌數(shù)量少的原因可能是前期的藥物治療造成的,也可能是該牛場的金黃色葡萄球菌本來就少。

本次試驗將傳統(tǒng)的微生物分離鑒定方法和16SrRNA分子生物學鑒定方法結合起來,分析奶牛乳房炎中主要致病菌的種類,不僅大大縮短了確定病原菌的時間,還能夠及時防治奶牛的乳房炎病癥,為快速鑒定乳房炎致病菌提供有效方法和科學依據(jù)。

參考文獻:

[1] 徐丹丹,楊彬,王建發(fā),等.圍產(chǎn)期奶牛乳房炎與E2、P4免疫調(diào)節(jié)作用及TLRs、NLRs介導天然免疫三者間的關系[J].中國獸醫(yī)學報,2016,36(8):1 455～1 463.

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