氨基多糖納米微粒對(duì)RAW264.7細(xì)胞分泌 TNF-α、IL-1β影響的試驗(yàn)

趙義龍,黃金鳳,趙金香,矯繼峰

(1.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,新疆 昌吉 831100;2.昌吉市華牧動(dòng)物診所,新疆 昌吉 831100;3.營(yíng)口理工學(xué)院 ,遼寧 營(yíng)口 115014)

氨基多糖(GAG)廣泛存在于動(dòng)物體內(nèi),在自然界中產(chǎn)量非常豐富。GAG具有輔助免疫、抗菌、抗病毒等生物學(xué)活性。納米材料是顆粒直徑在1～100 nm范圍內(nèi)且具有表面效應(yīng)、小尺寸效應(yīng)及量子尺寸效應(yīng)等特殊效應(yīng)的一類材料。氨基多糖納米微粒(Chitosan nanoparticle,CNP),是氨基多糖結(jié)合納米科技研制的新型多糖納米粒子。該納米微粒據(jù)推測(cè)除應(yīng)具有輔助免疫、抗菌等特性外應(yīng)兼具納

巨噬細(xì)胞是免疫效應(yīng)細(xì)胞,具有多種免疫功能,包括免疫防御、免疫監(jiān)視、免疫調(diào)節(jié)等,在機(jī)體的先天性免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用[1-2]。TNF-α、IL-1β是活化的巨噬細(xì)胞殺滅病原微生物、提高機(jī)體免疫力的主要細(xì)胞分子[3-4],因此本試驗(yàn)選擇鼠源巨噬細(xì)胞株RAW264.7來(lái)探討CNP對(duì)分泌細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的影響,揭示CNP促進(jìn)免疫功能的作用機(jī)理,為氨基多糖在動(dòng)物微生態(tài)制劑開發(fā)及綜合利用方面提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 氨基多糖納米微粒為浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所動(dòng)物分子營(yíng)養(yǎng)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室制備。TNF-α ELISA檢測(cè)試劑盒,購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司;IL-1βELISA檢測(cè)試劑盒,購(gòu)自武漢博士德生物技術(shù)有限公司;DMEM高糖培養(yǎng)液、胎牛血清、PBS、Hank′s,購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司;胰酶、DMSO,購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;RAW264.7細(xì)胞,購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海生化細(xì)胞所干細(xì)胞庫(kù)。

1.2 試驗(yàn)儀器 納米粒度及Zeta電位分析儀(Zetasizer Nano-ZS90,Malvern Instruments);超凈工作臺(tái)(HERA),購(gòu)自HermLe公司;CO2培養(yǎng)箱,購(gòu)自SANYO公司;倒置顯微鏡,購(gòu)自O(shè)lympus公司;多功能酶標(biāo)儀(MRX),購(gòu)自美國(guó)Dynex技術(shù)公司。

1.3 試驗(yàn)分組 將鼠源巨噬細(xì)胞RAW 264.7復(fù)蘇后,按常規(guī)細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng),待細(xì)胞對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)用于實(shí)驗(yàn),用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度至1×107個(gè)/mL,將每塊6孔板的3孔作為試驗(yàn)組、3孔作為對(duì)照組,做3次重復(fù)試驗(yàn)。每孔加入細(xì)胞懸液2 mL,置于5%CO2,37℃培養(yǎng)箱中孵育6 h,傾去培養(yǎng)液后,每孔加入2 mL含10%胎牛血清的無(wú)酚紅DMEM高糖培養(yǎng)液,試驗(yàn)組加入CNP(終濃度為0.3 mg/mL)0.2 mL,對(duì)照組則為DMEM完全培養(yǎng)液。因前期在裸鼠試驗(yàn)中采用終濃度為0.1 mg/mL、0.3 mg/mL、0.5 mg/mL、0.7 mg/mL進(jìn)行用藥測(cè)試,結(jié)果終濃度為0.3 mg/mL的用藥效果最好,故本試驗(yàn)選取其作為最佳終濃度。將細(xì)胞置于5%CO2、37℃培養(yǎng)12 h、18 h及24 h后收集細(xì)胞上清液,運(yùn)用酶聯(lián)免疫法測(cè)定CNP對(duì)細(xì)胞因子TNF-ɑ、IL-1β 的影響[5-6]。

1.4 數(shù)據(jù)分析 用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 19.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示。組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析,P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 各時(shí)間段CNP對(duì)TNF-ɑ的影響 通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CNP試驗(yàn)組(CNP劑量為0.2 mL)不同時(shí)間段對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7作用后其差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,具體如表1。

表1 各時(shí)間段CNP作用RAW264.7產(chǎn)生TNF-α的影響

由表1可知氨基多糖納米微粒(CNP)12 h加藥組與除24 h對(duì)照組外的各組均除差異顯著;18 h加藥組與其他各組均差異顯著;24 h加藥組與其他各組均差異顯著。因此說(shuō)明CNP對(duì)巨噬細(xì)胞分泌TNF-ɑ具有明顯的促進(jìn)作用。

2.2 各時(shí)間段CNP對(duì)IL-1β的影響 通過(guò)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),CNP試驗(yàn)組(CNP劑量為0.2 mL)不同時(shí)間段對(duì)巨噬細(xì)胞RAW264.7作用后其差異均存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,具體如表2。

表2 各時(shí)間段CNP作用RAW264.7產(chǎn)生IL-1β的影響

從表2可知,氨基多糖納米微粒(CNP)12 h加藥組與除18 h加藥組外其他各組均差異顯著;18 h加藥組與除12 h加藥組外其他各組均差異顯著;24 h加藥組與其他各組均差異顯著,因此說(shuō)明CNP對(duì)巨噬細(xì)胞分泌IL-1β具有一定的促進(jìn)作用。

3 討論

3.1 氨基多糖被認(rèn)為是迄今為止自然界惟一的一種帶陽(yáng)離子的天然多糖,在自然界中廣泛存在[7-9]。CNP是經(jīng)納米處理的帶有氨基的高分子材料,通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可以證明CNP能促進(jìn)巨噬細(xì)胞分泌TNF-α、IL-1β等細(xì)胞因子,對(duì)機(jī)體免疫系統(tǒng)有激活和促進(jìn)作用,其具有輔助免疫的特性。

3.2 RAW264.7巨噬細(xì)胞株是BALB/c小鼠腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)過(guò)白血病病毒誘生后產(chǎn)生的具有無(wú)限繁殖能力的細(xì)胞系,具有與腹腔細(xì)胞相同的功能和特點(diǎn),可以替代腹腔巨噬細(xì)胞并且避免了原代細(xì)胞不能無(wú)限繁殖的缺點(diǎn)[10-12]。本試驗(yàn)選取RAW264.7為巨噬細(xì)胞模型,即模擬體內(nèi)環(huán)境,又避免了原代細(xì)胞的缺陷,為本實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行提供基礎(chǔ)條件。

3.3 CNP可能通過(guò)多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)免疫細(xì)胞的功能和代謝,此為氨基多糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的重要機(jī)制,其中氨基多糖激活巨噬細(xì)胞從而調(diào)節(jié)免疫功能是較為重要的途徑[13]。CNP可以識(shí)別并結(jié)合巨噬細(xì)胞表面多種模式識(shí)別受體,經(jīng)各種信號(hào)傳導(dǎo)通路將信號(hào)傳入細(xì)胞內(nèi),引起細(xì)胞內(nèi)一系列的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng),從而調(diào)控相關(guān)基因表達(dá),分泌多種免疫活性物質(zhì)而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用[14]。

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