一例雞傳染性囊病的診斷及病毒分離鑒定

楊瑞梅,由 藝,秦志華,單 虎

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,山東 青島 266109)

雞傳染性囊病(IBD)是由傳染性囊病病毒引起的主要危害雛雞的急性傳染病[1]。該病毒主要侵害禽類的免疫中樞-腔上囊,腔上囊的損害使淋巴細胞大量減少,導(dǎo)致免疫抑制[2-3],從而對各種病原體易感性升高造成經(jīng)濟損失,因此給家禽養(yǎng)殖業(yè)帶來的危害不容小覷。傳染性囊病病毒分為I、II型兩個血清型,血清I型為雞源性,是導(dǎo)致發(fā)生IBD的主要血清型,血清I型病毒還可進一步分為不同的亞型,各亞型之間抗原相關(guān)性差異明顯,為10%～70%,這也是造成臨床上免疫失敗的重要原因之一[4-6]。病毒在感染宿主體內(nèi)主要分布于腔上囊和脾臟。傳染性囊病病毒本身的致死率并不特別高,但其能破壞患病動物的免疫系統(tǒng),近年來傳染性囊病臨床病例減少,但因該病腔上囊受損而引起禽流感、新城疫、支原體等病增多,因此從根本上仍需加強對IBD的防制。本試驗分離獲得了2017年山東青島地區(qū)的IBD分離株,為該病流行病學(xué)和防制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 TRIZol裂解液、dNTP、反轉(zhuǎn)錄酶(MLV)、Ex Taq酶、DL-2 000 Marker等,購自寶生物工程(大連)有限公司。

雞傳染性囊病瓊脂擴散試驗陽性血清、雞傳染性囊病瓊脂擴散標準抗原,購自青島易邦生物工程有限公司,生產(chǎn)批號:20170103。

1.2 方法

1.2.1 臨床癥狀 2017年5月山東青島市即墨某蛋雞散養(yǎng)戶共養(yǎng)500只38日齡蛋雞,病雞精神委靡,被毛蓬松,閉眼嗜睡,擠堆,不時排出白色水樣稀糞,病程長者,死亡雞爪干枯,發(fā)病率26%,死亡率4.2%。該雞14日齡免疫傳染性囊病弱毒疫苗。

1.2.2 病理變化 剖檢9只瀕死雞及死亡雞,病理變化:胸肌、腿肌有片狀出血;腔上囊腫大,個別腫大2～3倍,囊腔內(nèi)液體增多,黏膜上有點狀或片狀出血;腎臟呈花斑腎,輸尿管增粗充滿尿酸鹽。

1.2.3 瓊脂糖免疫擴散試驗 制備1%瓊脂糖凝膠板:稱取1.0 g 瓊脂糖、8 g NaCl和 0.01 g 硫柳汞(防腐),煮沸,倒平板、打孔、封底、加樣,在中央孔加IBDV標準陽性血清,周圍孔加待檢病雞腔上囊研磨液上清,同時用標準腔上囊抗原設(shè)陽性對照。置濕盒37℃恒溫箱中培養(yǎng)24～48 h觀察結(jié)果[7]。

1.2.4 病毒的雞胚培養(yǎng) (1)樣品組織的處理將病變腔上囊剪碎并充分進行研磨成勻漿,以1∶4比例加入生理鹽水混勻,反復(fù)凍融3次后加入10%雙抗(青霉素和鏈霉素,1 000 IU),4℃冰箱內(nèi)過夜,凍存?zhèn)溆?(2)病毒的雞胚接種9日齡SPF雞胚絨毛尿囊膜接種,將0.2 mL處理好的病料上清液緩緩注射到人造氣室中,用生物膜和石蠟封孔。人造氣室向上37℃恒溫保濕箱內(nèi),每12小時觀察1次,培養(yǎng)3-5 d。淘汰掉24 h內(nèi)死亡的雞胚;(3)病毒的收集取病變絨毛尿囊膜和病變胚體,勻漿,盲傳4代做檢測。

1.3 RT-PCR 檢測

1.3.1 引物設(shè)計與合成 根據(jù)GenBank發(fā)表的IBDV的基因組片段,參照Zierenberg等的研究報道[8],利用Premier 5.0軟件設(shè)計一對針對VP2基因的特異性PCR引物,擴增大小為750 bp目的片段,引物序列如表1。

表1 VP2基因的特異性引物

1.3.2 病毒核酸的擴增 TRIZol裂解法提取雞胚盲傳4代病毒,反轉(zhuǎn)錄后進行PCR。PCR擴增反應(yīng)體系:ddH2O 16 μL,10 × Ex Taq Buffer 2.5 μL,10 mmol/L dNTP 2 μL,上下游引物各 1 μL,cDNA 2 μL,Ex Taq 酶 0.5 μL。

在PCR擴增條件:98℃ 2 min;98℃10 s,55℃ 30 s,72℃ 45 s,循環(huán)30次,72℃ 10 min。電泳觀察結(jié)果。

1.3.3 PCR產(chǎn)物測序和序列比對 將PCR產(chǎn)物膠回收后,送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序,對測序結(jié)果進行GenBank Blast分析。

1.4 動物試驗及檢測 將雞胚分離病毒1∶5倍稀釋,用滴鼻方式接種12只30日齡SPF雛雞,150 μL/只,對照組雛雞用同樣方法接種等量生理鹽水。連續(xù)觀察記錄5～8 d,對死亡雞進行剖檢。

取攻毒病死雞腔上囊研磨,反復(fù)凍融后,取上清做瓊脂糖免疫擴散試驗。

2 結(jié)果

2.1 瓊脂糖免疫擴散試驗診斷結(jié)果 用發(fā)病雞場病死雞腔上囊研磨液做瓊擴,24 h后出現(xiàn)明顯沉淀線,見封三彩版圖1。結(jié)合臨床癥狀、病理變化及瓊擴結(jié)果,判定該雞場發(fā)生了IBD。

綜上所述，編纂書目索引、發(fā)表學(xué)術(shù)論文、出版學(xué)術(shù)專著，都是以文獻工作為起點，對文獻進行收集、整理和利用，形成系統(tǒng)性的揭示與研究。這既是圖書館文獻整理與服務(wù)工作的重要內(nèi)容，也是從事學(xué)術(shù)研究最基礎(chǔ)的工作，并使青年編纂群體的工作與治學(xué)呈現(xiàn)出相互融合與促進的特點。

2.2 病毒的雞胚培養(yǎng)結(jié)果 10日齡SPF雞胚第一代接種后3～4 d出現(xiàn)死亡,絨毛尿囊膜水腫增厚,尿囊液澄清透明;胚體全身水腫充血,軀干末端有出血點,腎臟充血,肝臟有出血點。連續(xù)傳4代,增殖病毒。

2.3 RT-PCR試驗結(jié)果 取第4代雞胚絨毛尿囊膜和胚體研磨物進行PCR擴增,在750 bp處出現(xiàn)一特異、明顯的條帶,與預(yù)期IBDV的片段大小相符。PCR產(chǎn)物測序結(jié)果在GenBank Blast中比對,與腔上囊病中國強毒株NB(AY319768)的同源性最高,為99.3%。表明雞胚盲傳4代產(chǎn)物中獲得了IBDV。見圖2。

圖2 RT-PCR法檢測分離病毒

2.4 動物試驗結(jié)果 將盲傳4代雞胚毒150 μL/只滴鼻接種SPF雛雞,接毒后第3天出現(xiàn)精神沉郁、縮頭不動、排白色稀糞的現(xiàn)象,第5～6天出現(xiàn)死亡,生理鹽水對照雛雞一直狀態(tài)良好。病理變化:尸體脫水;腿肌有點狀到片狀出血;腎臟水腫,呈“花斑腎”外觀;腔上囊腫脹,周圍有一些淡黃色膠胨樣物,腔上囊黏膜有出血點,囊腔內(nèi)有黃色黏液;直腸膨大,顏色蒼白,內(nèi)部充滿黃白色稀糞(見封三彩版圖3、圖4)。

攻毒后發(fā)病雞腔上囊研磨液做瓊擴,有致密明顯的白色沉淀線,為強陽性。表明攻毒病死雞腔上囊的組織中含有大量IBDV。

3 討論

3.1 IBDV培養(yǎng)方法 用雞胚絨毛尿囊膜增殖IBDV,是IBDV分離培養(yǎng)的良好方法。如果病料少,可先在30日齡SPF雞中增殖病毒,取攻毒雞病變腔上囊,再進行雞胚接種[9]。本研究通過以上方法獲得了一株山東青島地區(qū)IBDV分離株。雞胚絨毛尿囊膜接種可用天然氣室法和人造氣室法,天然氣室法操作簡單,但需揭開殼膜就會形成較大的與外界接觸的創(chuàng)面,雞胚被污染的幾率增高。人造氣室法形成的創(chuàng)面非常小,只有一個針頭大小,但是這種方法操作難度比較高,需很大耐心和細心,且耗時。建議用三角形細鐵絲等專用工具能使接種便利。

3.2 IBD的防控 目前,傳染性囊病的流行出現(xiàn)了一些新特點,發(fā)病日齡范圍擴大,發(fā)病率和死亡率增加,發(fā)病的表現(xiàn)不明顯,病程延長,造成免疫極易失敗,且出現(xiàn)了免疫抑制。本次發(fā)病雞盡管14日齡免疫傳染性囊病弱毒疫苗,可能因為環(huán)境中有野毒,且毒力較強,未能保護該雞群發(fā)病。另外,育雛室徹底消毒很關(guān)鍵。本次發(fā)病由于育雛室在放入雛雞前雖已消毒,但不徹底,地面仍可見糞便干涸物,對該病的發(fā)生有直接影響。搞好育雛舍消毒是防制該病的重要環(huán)節(jié),嚴格消毒,可大大降低發(fā)病率[10]。在本研究中分離得到了IBDV,但其毒力仍未用試驗檢測,下一步將進行這方面工作。

總之,通過臨床癥狀、病理變化和實驗室檢驗對1例傳染性囊病病例進行了確診,并通過SPF雞胚、SPF雞接種,培養(yǎng)獲得了傳染性囊病病毒,為該病流行病學(xué)和防制研究奠定基礎(chǔ)。

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