仔豬斷奶應(yīng)激對(duì)腸道功能和組織結(jié)構(gòu)影響的研究

于光輝,姜建陽(yáng),王西彤,張華杰,耿 梅,宋春陽(yáng)

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院,山東 青島 266109;2.威海市動(dòng)物疾病控制預(yù)防中心,山東 威海 264200)

仔豬斷奶是其生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中的一個(gè)必經(jīng)階段,母子分離、營(yíng)養(yǎng)和環(huán)境改變而造成體內(nèi)穩(wěn)態(tài)失調(diào)[1]。通過(guò)添加一些營(yíng)養(yǎng)性飼料添加劑、藥物、植物提取物、微生態(tài)制劑等都能緩解斷奶應(yīng)激,并且在生產(chǎn)上也取得了良好的效果,但是始終沒(méi)能全面、深入地揭示仔豬斷奶應(yīng)激的分子機(jī)制。眾所周知,中國(guó)地方品種豬經(jīng)過(guò)幾千年的遺傳進(jìn)化,有著豐富的遺傳多樣性,它們更能適應(yīng)當(dāng)?shù)氐臍夂颦h(huán)境,并且比國(guó)外品種有獨(dú)特的抗逆性,斷奶應(yīng)激反應(yīng)相對(duì)較小。萊蕪豬是我國(guó)一個(gè)優(yōu)秀的地方品種,與國(guó)外品種相比具有抗病力強(qiáng)和肌內(nèi)脂肪含量高等優(yōu)異的性狀[2];杜長(zhǎng)大是養(yǎng)豬生產(chǎn)中常用的雜交組合,能夠表現(xiàn)出很好的生產(chǎn)成績(jī)。利用品種對(duì)比來(lái)研究仔豬斷奶應(yīng)激,探索斷奶應(yīng)激對(duì)腸道功能和組織變化是本研究的出發(fā)點(diǎn),這將進(jìn)一步揭示仔豬斷奶應(yīng)激的差異,為以后抗斷奶應(yīng)激豬的分子機(jī)制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 試驗(yàn)選擇同一日齡出生的健康杜長(zhǎng)大仔豬和萊蕪豬各10頭(同一窩)作為試驗(yàn)動(dòng)物。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)進(jìn)行42 d,兩品種均于28日齡斷奶。每個(gè)品種為1個(gè)處理,分別于仔豬斷奶前1 周(21 d)、斷奶當(dāng)天(28 d)、斷奶后1 d(29 d)、斷奶后1周(35 d)及斷奶后2周(42 d)時(shí)每個(gè)品種每個(gè)階段選取2頭仔豬屠宰取樣,所有試驗(yàn)豬進(jìn)行相同的飼養(yǎng)和管理。

1.3 飼養(yǎng)管理 豬的飼養(yǎng)試驗(yàn)在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)生教學(xué)實(shí)習(xí)基地進(jìn)行,仔豬出生第2天補(bǔ)鐵,第5天開(kāi)始補(bǔ)飼,第28天時(shí)斷奶,將其轉(zhuǎn)入保育室飼喂全價(jià)料,自由采食和飲水。

1.4 樣品采集 于仔豬斷奶前1周、斷奶當(dāng)天、斷奶后1 d、斷奶后1周及斷奶后2周時(shí)每個(gè)品種每個(gè)階段選取2頭體重相近的仔豬,于當(dāng)日早晨9:00稱重后放血致死,打開(kāi)腹腔立即結(jié)扎幽門(mén)瓣、回盲瓣、胰腺管,以防止消化道樣品的相互污染。迅速取出小腸置于預(yù)先冰冷的生理鹽水中,取出胰腺剝離脂肪組織和結(jié)締組織并稱重后,立即放入液氮速凍,然后移入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。取十二指腸近端、空腸前段、空腸后段、回腸中段、盲端的食糜于離心管中,迅速放入液氮速凍,然后轉(zhuǎn)入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩＜羧∈改c中段、空腸前段的腸道組織2 cm左右,浸入4%甲醛中進(jìn)行固定。

1.5 測(cè)定指標(biāo)與方法

1.5.1 消化酶活性 分別測(cè)定胰腺蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、空腸前段的蔗糖酶和乳糖酶活性,并計(jì)算酶活性。胰腺上清液的制備:準(zhǔn)確稱取一定量的胰腺組織,按重量體積比(w/v)加9倍體積的勻漿介質(zhì),在冰浴條件下2 500 r/min離心10 min,取上清液即得10%粗酶液,于-20℃冷凍保存待測(cè)。蔗糖酶、乳糖酶粗酶液的制備:準(zhǔn)確稱取一定量的腸道食糜,按重量體積比(w/v)加9倍體積的勻漿介質(zhì),在冰浴條件下2 500 r/min離心10 min,取上清液即得10%粗酶液,于-20℃冷凍保存待測(cè)。各種酶活的測(cè)定都采用購(gòu)自南京建成生物工程研究所的試劑盒,并用分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.5.2 組織切片觀察 甲醛固定好的腸道組織用石蠟包埋后做成石蠟切片,經(jīng)高碘酸-雪夫染色反應(yīng)后進(jìn)行觀察。用帶有測(cè)微目鏡的顯微鏡(Olympus,BX51,Japan)計(jì)量小腸絨毛長(zhǎng)度和隱窩深度,每個(gè)組織計(jì)量10次取平均值。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 兩品種間和品種內(nèi)不同時(shí)期的數(shù)據(jù)用SAS軟件GLM過(guò)程進(jìn)行方差分析,數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 消化酶活性 動(dòng)物的消化酶活性是胃腸道功能的重要表現(xiàn)形式,兩品種仔豬斷奶前后消化酶活性見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn),兩品種間的比較表明,兩品種仔豬的胰腺蛋白含量在斷奶前1周差異不顯著,但是在斷奶后1 d和1周萊蕪豬比杜長(zhǎng)大分別高41.94%(P<0.01)和81.48%(P<0.01),到斷奶后2周又差異不顯著(P>0.05)。胰蛋白酶的活性萊蕪豬比杜長(zhǎng)大在斷奶當(dāng)天、斷奶后1 d、1周和2周分別高4.07%(P<0.05)、21.44%(P<0.01)、57.10%(P<0.01)和34.80%(P<0.01);但是萊蕪豬胰脂肪酶的活性只在斷奶前1周、斷奶當(dāng)天和斷奶后1 d比杜長(zhǎng)大差異顯著(P<0.05或者P<0.01);胰淀粉酶也呈相同的趨勢(shì)。萊蕪豬的乳糖酶在斷奶后1 d和1周比杜長(zhǎng)大低37.12%(P<0.05)和22.93%(P<0.05),但是在斷奶后2周比杜長(zhǎng)大高39.98%(P<0.01)。

從不同斷奶時(shí)期的比較來(lái)看,萊蕪豬的胰腺蛋白含量在斷奶當(dāng)天比斷奶前1周增加了46.67%,但是斷奶后1 d、1周和2周比斷奶當(dāng)天分別降低42.86%(P<0.01)、4.55%(P<0.05)和 8.44%(P>0.05);杜長(zhǎng)大仔豬胰腺蛋白含量也呈相同的趨勢(shì)。胰蛋白酶、胰脂肪酶、胰淀粉酶、蔗糖酶、乳糖酶的活性在斷奶后都呈下降的趨勢(shì),但是萊蕪豬的消化酶活性比杜長(zhǎng)大下降幅度要小些,或者能夠在較短時(shí)間內(nèi)很快上升。

2.2 腸絨毛長(zhǎng)度和隱窩深度 兩品種仔豬斷奶前后十二指腸和空腸腸絨毛長(zhǎng)度和隱窩深度變化情況見(jiàn)表2。

由表2可見(jiàn),兩品種間比較結(jié)果表明,萊蕪豬十二指腸絨毛在斷奶前1周比杜長(zhǎng)大高17.03%(P<0.05),斷奶后1 d差異不顯著,但是斷奶后1周又比杜長(zhǎng)大高73.62%(P<0.01)。萊蕪豬的空腸絨毛在斷奶前1周、斷奶后1 d和斷奶后1周比杜長(zhǎng)大分別高14.24%(P<0.01)、10.69%(P<0.01)和65.63%(P<0.01)。兩品種仔豬十二指腸的隱窩深度在斷奶前1周和斷奶后1 d差異不顯著,但是萊蕪豬在斷奶后1周比杜長(zhǎng)大要淺6.14%(P<0.05)。萊蕪豬的隱窩深度斷奶后1 d比斷奶前1周增加9.59%(P>0.05),斷奶后1周比斷奶后1 d降低1.55%(P>0.05);而杜長(zhǎng)大斷奶后1 d比斷奶前1周降低2.00%(P>0.05),斷奶后1周比斷奶后1 d增加13.93%(P<0.01)。萊蕪豬空腸的隱窩深度比杜長(zhǎng)大在斷奶前1周、斷奶后1 d、斷奶后1周分別要深24.08%(P<0.01)、16.77%(P<0.01)、3.65%(P>0.05)。

表1 斷奶對(duì)不同品種仔豬胰臟蛋白含量及消化酶活性的影響

2.3 斷奶前后腸道組織結(jié)構(gòu) 兩品種仔豬斷奶前后十二指腸和空腸腸道發(fā)育的變化見(jiàn)圖1。

由圖1可見(jiàn),兩品種仔豬在斷奶前1周十二指腸和空腸的腸絨毛長(zhǎng)度差異不明顯,都呈規(guī)則的手指狀,且腸絨毛排列緊密有序(A1和B1);斷奶當(dāng)天變化不大(A2和B2);斷奶后1周萊蕪豬的十二指腸絨毛出現(xiàn)空泡化(A3),杜長(zhǎng)大的十二指腸絨毛有部分?jǐn)嗔鸦蛘呙撀?B3);萊蕪豬的空腸絨毛變粗變短(A4),杜長(zhǎng)大的空腸絨毛脫落嚴(yán)重,并且比萊蕪豬的更短(B4)。

3 討論

3.1 仔豬斷奶應(yīng)激影響豬的生產(chǎn)性能 仔豬斷奶母子分離導(dǎo)致仔豬嚴(yán)重的應(yīng)激反應(yīng),并且會(huì)挫傷腸道和免疫系統(tǒng)的功能,在斷奶后第一周尤為嚴(yán)重,影響仔豬的健康、生長(zhǎng)、采食量等。生產(chǎn)中采取各種措施來(lái)應(yīng)對(duì)仔豬的斷奶應(yīng)激,如改善生活環(huán)境、提高營(yíng)養(yǎng)水平、增強(qiáng)機(jī)體免疫、改變管理模式等,在一定程度上緩解了斷奶應(yīng)激[3]。

3.2 仔豬斷奶應(yīng)激降低消化酶活性 消化酶活性降低是引起斷奶仔豬腹瀉的主要原因,胰腺是最重要的消化器官之一,分泌多種消化酶,如胰蛋白酶、胰脂肪酶和胰淀粉酶等。仔豬斷奶應(yīng)激降低胰腺的分泌能力和消化酶的活性[4]。胰脂肪酶活性在斷奶后逐漸降低,在斷奶后2周回復(fù)正常水平(表1)。仔豬斷奶后1 d小腸蔗糖酶活性迅速下降(大約下降85%),斷奶后2 d比斷奶后1 d下降30%左右[5]。

表2 斷奶前后不同品種豬腸道絨毛和隱窩變化

圖1 仔豬斷奶前后腸道組織變化圖

3.3 仔豬斷奶應(yīng)激影響腸道組織結(jié)構(gòu) 仔豬斷奶前,絨毛高度隨日齡增長(zhǎng)逐漸變長(zhǎng),隱窩深度變淺。斷奶后,食物由液體母乳向固體飼料轉(zhuǎn)變,固體飼料中存在抗?fàn)I養(yǎng)因子及抗原蛋白引發(fā)過(guò)敏反應(yīng),表現(xiàn)為絨毛高度降低,隱窩深度加深[6-7],絨毛高度/隱窩深度的比值顯著降低。小腸絨毛高度和隱窩深度的比值決定了仔豬腸道的消化吸收能力,比值越大,表明腸道吸收面積越大,消化吸收能力越高[8]。斷奶24 h后腸絨毛高度降低25%,5 d內(nèi)絨毛高度繼續(xù)縮短,隱窩加深,到第5天時(shí),降低為原來(lái)的50%,隨后開(kāi)始逐漸恢復(fù)[9]。隱窩深度能夠反映細(xì)胞的形成能力,淺的隱窩深度加快了細(xì)胞的成熟,提高腸道的分泌能力[10]。本試驗(yàn)結(jié)果表明,腸絨毛在斷奶后1周逐漸降低,腸絨毛的形態(tài)從手指狀變?yōu)楸馄綘?但是萊蕪豬的腸絨毛形態(tài)變化要小些(圖1)。兩品種仔豬斷奶后隱窩深度都增加,但是空腸的變化差異不顯著(P>0.05)(表2)。

本研究消化酶活性和腸道組織結(jié)構(gòu)變化兩方面,對(duì)比研究了萊蕪豬和杜長(zhǎng)大仔豬斷奶應(yīng)激的差異。地方品種萊蕪豬在生產(chǎn)上表現(xiàn)為抗斷奶應(yīng)激能力比較強(qiáng),通過(guò)指標(biāo)的測(cè)定發(fā)現(xiàn)萊蕪豬比杜長(zhǎng)大有更高的消化酶活性,并且斷奶后腸道組織損傷較輕,能夠很快恢復(fù),表明萊蕪豬比杜長(zhǎng)大有更強(qiáng)的抗斷奶應(yīng)激能力。

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