蜘蛛粉中糖胺聚糖提取工藝的優(yōu)化

桑 曉，韓海燕，王彥多，劉 穎，曹廣超，王 靜，黃志強(qiáng)，方 園，毛會(huì)秀，王集會(huì)

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250355；2.山東中醫(yī)藥大學(xué) 實(shí)驗(yàn)中心，山東 濟(jì)南 250355；3.東北林業(yè)大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

蜘蛛又名網(wǎng)蟲、園蛛、扁蛛、盤絲仙，是蜘蛛目所有種的統(tǒng)稱[1]。據(jù)相關(guān)期刊報(bào)道，目前全球確定的蜘蛛種類大約有4萬種，其中在中國已經(jīng)確定的大約4000種[2]。蜘蛛分布較廣，適應(yīng)性較強(qiáng)，大多數(shù)的蜘蛛具有毒腺，蜘蛛毒素能有效殺死癌細(xì)胞。據(jù)文獻(xiàn)資料顯示，蜘蛛具有較高的藥用價(jià)值。據(jù)《雷公炮炙論》記載，蜘蛛去除頭、足，然后研如膏，便可和其他中藥材一起治療疾病。傳統(tǒng)中醫(yī)認(rèn)為，蜘蛛性甘、微苦、微寒、有毒、歸肝經(jīng)，具有祛風(fēng)、消腫、解毒、消腫瘤、散結(jié)等效用?，F(xiàn)今蜘蛛作為藥材使用，主要治療毒蟲咬傷，腎陽虧損，中風(fēng)口斜、鼻炎、脫肛、肺結(jié)核[5]等癥。

糖胺聚糖(glycosaminoglycan, GAG)又被稱為黏多糖[6],因其溶解度多具有較高粘度而得名[7]，是普遍存在于動(dòng)物體內(nèi)，植物中也有發(fā)現(xiàn)的復(fù)合多糖[8-10]。糖胺聚糖分子中含有糖醛基和氨基糖殘基[11-12]，并由于糖胺聚糖含羧基比例較高，且多含硫酸基，具有較強(qiáng)的酸性，也稱酸性黏多糖[13]。糖胺聚糖具有多種藥理作用，能促進(jìn)傷口愈合，能提高機(jī)體免疫能力，而且多數(shù)不具有毒副作用，是比較理想的藥物成分[14-15]。糖胺聚糖具有抗凝血、抗血栓、降血脂、抗炎癥、抗病毒、抗腫瘤[16]、抗衰老、預(yù)防骨質(zhì)疏松等藥用價(jià)值，在生物藥物新藥研發(fā)中日益受到人們的青睞[17-18]。

本實(shí)驗(yàn)采用紫外可見分光光度法,以蜘蛛粉中糖胺聚糖的提取量為指標(biāo)[18]，以料液比、提取溫度、提取時(shí)間為試驗(yàn)因素[19-21]，通過三因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)來探討糖胺聚糖的最佳提取工藝。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 儀器設(shè)備

UV9100B紫外可見分光光度計(jì)(北京萊伯泰科儀器有限公司)；康世潔PL-S20小型超聲波清洗機(jī)(東莞康世潔超聲波科技有限公司)；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；FA1004N電子天平(上海精密科學(xué)儀器有限公司)；HWI電熱恒溫水溫箱(北京醫(yī)療設(shè)備廠)；遠(yuǎn)紅外輻射干燥箱(上海陽光實(shí)驗(yàn)儀器有限公司)；雷磁PHS-25 數(shù)顯pH計(jì)(上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

硫酸軟骨素對照品(北京索萊寶科技有限公司,批號：9007-28-7)，氫氧化鈉，胰蛋白酶，硫酸，無水乙醇，磷酸，石油醚，等試劑均為分析純。

1.3 供試品

蜘蛛粉(從河北安國中藥材市場購買，由山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院高德民副教授鑒定為圓蛛科圓網(wǎng)蛛屬大腹園蛛Arunea ventricosa(L.Koch))。

2 試驗(yàn)方法

2.1 阿利新藍(lán)溶液的制備

精密稱取0.1100 g阿利新藍(lán)8GX，加入到0.15 g·mL-1H3PO4-0.02g·mL-1H2SO4的混合液(1∶1，V/V)中，調(diào)pH值=1,定容至100 mL得備用液。

2.2 對照品溶液的制備

精密稱取0.1000 g 硫酸軟骨素對照品，定容至100 mL，分別精確量取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL的硫酸軟骨素溶液加入至具塞試管中，在各個(gè)試管中分別加入蒸餾水1.0、0.9、0.8、0.6、0.4、0.2 mL。在各個(gè)試管中添加提前溶解好的阿利新藍(lán)溶液15 ml，放置15 min后得備用液。

2.3 吸收波長的確定

采用阿利新藍(lán)比色法，以硫酸軟骨素為對照品，在300～700nm處進(jìn)行全波長掃描。

2.4 供試品溶液的制備

精密稱取蜘蛛粉1.0000 g,按1∶2加入石油醚和無水乙醇進(jìn)行脫脂2h，脫脂、抽濾后按一定的料液比加入蒸餾水。然后在40 ℃，pH值=8，胰蛋白酶2000 U的條件下酶解3h，然后在一定的溫度和時(shí)間下進(jìn)行超聲提取2次，進(jìn)行抽濾，收集濾液,放至4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

精密稱取0.1000 g硫酸軟骨素對照品，定容至100 mL，分別精確量取0、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8 mL的硫酸軟骨素溶液加入至具塞試管中，在各個(gè)試管中分別加入蒸餾水1.0、0.9、0.8、0.6、0.4、0.2 mL。各個(gè)試管中添加提前溶解好的阿利新藍(lán)溶液15 mL，放置15 min。在490 nm波長處測定吸光度。以波長(C)為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2.6 單因素實(shí)驗(yàn)

2.6.1 料液比對蜘蛛粉中糖胺聚糖提取量的作用

在確保提取溫度50 ℃、提取時(shí)間80 min 不變的情況下，改變料液比，在料液比 1∶20，1∶30,1∶40,1∶50,1∶60 g·mL-1下提取糖胺聚糖，考察料液比對糖胺聚糖提取量的作用。

2.6.2 提取時(shí)間對蜘蛛粉中糖胺聚糖提取量的作用

在確保液料比 1∶40 g·mL-1，提取溫度50 ℃ 不變的情況下，改變提取時(shí)間，在提取時(shí)間為60、70、80、90、100 min下提取糖胺聚糖，考察提取時(shí)間對糖胺聚糖提取量的作用。

2.6.3 提取溫度對蜘蛛粉中糖胺聚糖提取量的作用

在確保料液比 1∶40 g·mL-1，提取時(shí)間80min不變的情況下，改變提取溫度，在提取溫度為30、40、50、60 ℃ 下提取糖胺聚糖，考察提取溫度對糖胺聚糖提取量的作用。

2.7 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以料液比(A)，提取時(shí)間(B)，提取溫度(C)為三個(gè)考察因素。優(yōu)化蜘蛛粉中糖胺聚糖的提取工藝，采用 L9(34)正交試驗(yàn)，見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素

2.8 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS19.0進(jìn)行單因素方差分析，P<0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著差異的標(biāo)準(zhǔn)[20-21]。

3 結(jié)果與分析

3.1 硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)品最大吸收波長

經(jīng)在可見光下掃描，確定硫酸軟骨素最大吸收波長在490 nm處，如圖1所示。

圖1 硫酸軟骨素全波長掃描圖

3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性與范圍

硫酸軟骨素對照品標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：y=1.0137X-0.0004，R2=0.9993,見表2及圖2。

表2 硫酸軟骨素線性關(guān)系實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 硫酸軟骨素標(biāo)準(zhǔn)曲線

3.3 單因素試驗(yàn)

3.3.1 液料比對蜘蛛粉中糖胺聚糖提取量的作用

糖胺聚糖提取量隨著料液比的增大先增加后降低，在料液比為1∶40 g·mL-1處出現(xiàn)最大值，可能由于料液比過小，則糖胺聚糖溶出量為飽和，不利于糖胺聚糖的充分溶出；而當(dāng)料液比過高，非糖胺聚糖類物質(zhì)競相溶出導(dǎo)致糖胺聚糖溶出量減少[22]。所以確定糖胺聚糖提取的最佳提取料液比為1∶40 g·mL-1。結(jié)果見圖 3。

圖3 料液比對糖胺聚糖提取量的作用

3.3.2 提取時(shí)間對蜘蛛粉中糖胺聚糖提取量的作用

糖胺聚糖提取量隨著提取時(shí)間增大先增大后逐漸趨于平緩，可能是因?yàn)樘前肪厶墙隽恳呀?jīng)達(dá)到飽和，不再溶出。從節(jié)約能源方面考慮，確定糖胺聚糖提取的最佳提取時(shí)間是80 min。結(jié)果見圖4。

圖4 提取時(shí)間對糖胺聚糖提取量的作用

3.3.3 提取溫度對蜘蛛粉中糖胺聚糖提取量的作用

糖胺聚糖提取量隨著提取溫度增大先增加后降低，當(dāng)溫度為50 ℃ 時(shí)具有最高點(diǎn) ，這是因?yàn)殡S溫度升高，分子熱運(yùn)動(dòng)加劇，利于糖胺聚糖破壁溶出，但溫度過高，部分蛋白變性失活凝固不利于糖胺聚糖溶出，所以確定糖胺聚糖提取的最佳提取溫度為50 ℃。結(jié)果見圖5。

圖5 提取溫度對糖胺聚糖提取量的作用

3.4 正交實(shí)驗(yàn)

本實(shí)驗(yàn)采用的是正交試驗(yàn)法，正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表3。

表3 正交實(shí)驗(yàn)表結(jié)果

表4 方差分析表

注：F0.05(2,2)=19，P<0.05為顯著， P<0.01為極顯著。

由表4得出：料液比(A)，提取時(shí)間(B)，提取溫度(C)對蜘蛛粉中糖胺聚糖的提取均具有明顯性的作用。料液比、提取時(shí)間、提取溫度對糖胺聚糖的提取量作用程度為：料液比(A)>提取時(shí)間(B)>提取溫度(C)。因此，得到在正交試驗(yàn)范圍內(nèi)的最佳提取條件是A2B3C1，即料液比為1∶40 g·mL-1，提取時(shí)間為80 min，提取溫度為50 ℃。

3.5 實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證結(jié)果

在正交試驗(yàn)范圍內(nèi)的最佳提取條件A2B3C1下，進(jìn)行三次實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表5。

表5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果驗(yàn)證

由表5可知，按最佳提取條件：料液比1∶40 mg/mL,提取時(shí)間80 min,提取溫度50 ℃，從1.0000 g 的蜘蛛粉中提取糖胺聚糖，平均提取量為21.072 mg·g-1，提取量較高且具有重復(fù)性，驗(yàn)證了所選提取工藝參數(shù)的合理性。

4 討論

由方差分析得出：料液比對蜘蛛粉中糖胺聚糖的提取作用最顯著，其中當(dāng)料液比為1∶40時(shí)提取量達(dá)到最高。提取時(shí)間對蜘蛛粉中糖胺聚糖的提取作用的程度比料液比對蜘蛛粉中糖胺聚糖的提取作用的程度弱一點(diǎn)，當(dāng)提取時(shí)間為80 min時(shí)提取量較高。提取溫度對蜘蛛粉糖胺聚糖的提取效果也有較大的作用，但不如料液比及提取時(shí)間對蜘蛛粉中糖胺聚糖的提取的作用強(qiáng)。其中，當(dāng)提取溫度為50 ℃ 時(shí)，提取含量最高。本實(shí)驗(yàn)采用正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化蜘蛛粉中糖胺聚糖最佳提取工藝，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果得出料液比對糖胺聚糖的提取作用最顯著，是蜘蛛粉中糖胺聚糖提取的關(guān)鍵因素。通過最佳提取工藝，對蜘蛛粉中糖胺聚糖進(jìn)行提取，提取量為21.072 mg·g-1，試驗(yàn)方法重復(fù)性高，可用于其他藥物糖胺聚糖工藝提取。

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