瘦素對人乳腺癌MCF-7細胞DMBT1表達的影響*

魏 萌，司麗娜，陳 磊，程露陽，楊松鶴

（承德醫(yī)學院基礎醫(yī)學院，河北承德 067000）

乳腺癌是嚴重威脅女性生命與健康的惡性腫瘤之一，在中國，乳腺癌發(fā)病率已占女性惡性腫瘤首位[1]。肥胖已成為世界范圍內的公共健康問題，而肥胖已被證實與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及轉移密切相關[2]。瘦素是肥胖基因（obese gene，Ob）的產物，具有調節(jié)能量平衡、生殖、免疫、炎癥、造血及細胞增殖等多種生物學作用[3]。研究顯示，瘦素可通過正向調節(jié)雌激素的分泌，進而影響乳腺癌的發(fā)生發(fā)展[4]。DMBT1基因（deleted in malignant brain tumors）是一種候選的腫瘤抑制基因[5]，也有研究證實，DMBT1是受雌激素調節(jié)的基因[6]?；谏鲜鲅芯拷Y果，本研究觀察了瘦素對雌激素受體陽性（ER+）乳腺癌MCF-7細胞DMBT1表達的影響，為進一步探討DMBT1在雌激素受體陽性（ER+）乳腺癌中的生物學作用提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 細胞和試劑 雌激素受體陽性（ER+）的人乳腺癌細胞株MCF-7，由北京協(xié)和細胞資源中心提供。人瘦素重組蛋白，購自以色列ProSpec公司；DMBT1兔抗多克隆抗體（sc-28239），購自美國Santa Cruz公司；β-actin小鼠單克隆抗體（ab8226），購自英國Abcam公司；RPMI1640培養(yǎng)基，購自美國Gibco公司。

1.2 細胞培養(yǎng) 人乳腺癌MCF-7細胞接種于含10%胎牛血清、100U/ml青霉素及100U/ml鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)基中，置于37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)。

1.3 MTT法檢測MCF-7細胞的增殖率 取對數(shù)期生長細胞接種于96孔板，調細胞濃度為1×104/孔，置37℃、5%CO2孵箱中培養(yǎng)使細胞貼壁。培養(yǎng)24h后，給予不通濃度人瘦素重組蛋白液（0ng/ml、100ng/ml、200ng/ml、400ng/ml、800ng/ml）作用于細胞24h，每個濃度設3個復孔，同時設調零孔和對照孔。采用MMT法用酶標儀于波長490nm處檢測吸光值（A），計算增殖率。增殖率（PR）=實驗組A值/對照組A值×100%。

1.4 蛋白印跡法檢測MCF-7細胞DMBT1蛋白的表達水平收集實驗組（瘦素800ng/ml，作用24h）及對照組（不含藥物組）的細胞，提取總蛋白，蛋白定量后SDSPAGE（分離膠10%，堆積膠4%）電泳分離后電轉（250mA，90min）至PVDF膜，一抗（DMBT1 1：500，β-actin 1：2000）4℃過夜，二抗孵育后化學發(fā)光法顯色。圖像掃描后采用Image J軟件分析條帶灰度，以DMBT1條帶灰度值與β-actin條帶灰度值的比值作為DMBT1蛋白的相對含量。

1.5 統(tǒng)計分析 用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料的比較采用單因素方差分析和t檢，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 細胞增殖率 瘦素能明顯促進MCF-7細胞增殖，隨著瘦素濃度的升高，MCF-7細胞的增殖率逐漸升高（P＜0.05）。見附表：

附表 不同濃度瘦素作用24h對MCF-7細胞增殖率的影響

2.2 MCF-7細胞DMBT1蛋白表達的變化 蛋白印跡法結果顯示，瘦素（800ng/ml）組中DMBT1蛋白含量為（76.99±0.26），明顯高于對照組的（27.05±0.38），組間比較差異具有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。

3 討論

眾所周知，雌激素水平升高可提高乳腺癌的發(fā)病率[7]，而肥胖是絕經后婦女發(fā)生乳腺癌的另一個重要誘因[8]。研究顯示，肥胖群體中的乳腺癌患者瘦素水平明顯升高，而高水平的瘦素可促進雌激素依賴的乳腺癌細胞增殖[9]。DMBT1是由Molleuhancer等人發(fā)現(xiàn)的一種候選腫瘤抑制基因，該基因常在腦組織惡性腫瘤中丟失，故而得名。DMBT1表達下調、缺失、突變失活與多種腫瘤、特別是上皮細胞腫瘤的發(fā)生密切相關。在多種腫瘤中，如胃癌、肺癌，DMBT1表達與淋巴結轉移、腫瘤浸潤存在明顯相關性[10-11]。目前，DMBT1與乳腺癌的關系還處于爭論中，有研究顯示DMBT1在乳腺癌中表達下調[12]；同時，有研究顯示DMBT1也是一個受雌激素調節(jié)的基因，雌激素拮抗劑ICI182、780能抑制雌激素誘導的去勢大鼠子宮內膜上皮細胞DMBT1 mRNA表達水平的升高[6]。本研究觀察發(fā)現(xiàn)，瘦素作用下的雌激素受體陽性（ER+）的人乳腺癌MCF-7細胞，DMBT1蛋白的表達水平明顯升高，說明瘦素可能通過正向調節(jié)雌激素的分泌，從而發(fā)揮對雌激素反應蛋白DMBT1的調節(jié)作用。但DMBT1在雌激素受體陽性（ER+）乳腺癌中的表達情況還需要進一步驗證，以分析DMBT1能否做為乳腺癌診斷、治療及預后監(jiān)控的指標。

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