17-AAG對人絨毛膜癌JAR細胞MMP-2和MMP-9表達的調(diào)控作用*

谷 苗，崔麗軍，劉百藝，安國慶，許 倩

（承德醫(yī)學院，河北承德 067000）

人絨毛膜癌是一種來源于滋養(yǎng)細胞的惡性腫瘤，由于滋養(yǎng)細胞具有胚胎細胞的特性，導致絨癌早期即發(fā)生血道轉(zhuǎn)移，波及全身，危及患者生命。熱休克蛋白90（HSP90）是許多癌基因通路中的重要組成部分，因此HSP90是腫瘤治療中非常有前景的分子靶點[1]。17-丙烯胺基-17-去甲氧基格爾德霉素（17-AAG）作為HSP90的抑制劑在骨肉瘤[2]、膽囊癌[3]、肺癌[4]及乳腺癌[5]等的研究中具有抑制腫瘤細胞生長、誘導腫瘤細胞凋亡的作用，但關(guān)于17-AAG對人絨毛膜癌JAR細胞的抗癌作用國內(nèi)外鮮有報道。本研究以人絨癌JAR細胞為研究對象，觀察了

17-AAG對人絨毛膜癌JAR細胞基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2)、MMP-9蛋白表達的調(diào)控作用，初步探尋17-AAG對JAR細胞侵襲、轉(zhuǎn)移的干預作用，為17-AAG對人絨毛膜癌治療作用的研究提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與主要儀器 人絨毛膜癌JAR細胞系（廣州吉尼歐生物科技有限公司），胎牛血清（FBS）、DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；17-AAG（深圳生爾易美有限公司）；鼠抗MMP-2單克隆抗體、兔抗MMP-9單克隆抗體、兔抗GAPDH單克隆抗體（美國Abcam公司）；酶標儀（美國BioTek Cytation5）。

1.2 細胞培養(yǎng) 人絨毛膜癌JAR細胞用含15% FBS的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2-3天更換培養(yǎng)基，取對數(shù)生長期的細胞進行后續(xù)實驗。

1.3 MTT法檢測絨癌JAR細胞的增殖抑制率 取細胞狀態(tài)良好、對數(shù)生長期的JAR細胞，胰酶消化計數(shù)，按5×103/ml接種于96孔板中，設(shè)置對照組、實驗組、空白組。待細胞長到密度為90%左右時，對照組細胞不加17-AAG，實驗組細胞加入不同濃度的17-AAG，分別為5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml，每組設(shè)5個復孔。培養(yǎng)48h后，加入MTT（5μg/ml），每孔10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h，吸掉培養(yǎng)液，每孔加入二甲基亞砜150μl，震蕩15min，酶標儀于波長490nm處檢測吸光度。計算JAR細胞的增殖抑制率。增殖抑制率=（1-實驗組OD值/對照組OD值）×100%，并計算藥物半數(shù)抑制濃度（IC50）。

1.4 Western blotting法檢測絨癌JAR細胞MMP-2、MMP-9蛋白的表達 取細胞狀態(tài)良好、對數(shù)生長期的JAR細胞接種于6孔板中，待細胞長到密度為90%左右時，分別加入0μg/ml（對照組）、5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml濃度的17-AAG。繼續(xù)培養(yǎng)24h后，加入RIPA蛋白裂解液提取各組細胞的總蛋白，并檢測蛋白濃度。60μg蛋白上樣量進行12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，采用PVDF膜進行轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉1h，加入5%脫脂奶粉稀釋的一抗MMP-2（1：2000）、MMP-9（1：2000）4℃孵育過夜，GAPDH（1：4000）作為內(nèi)參。然后加入5%脫脂奶粉稀釋的二抗(1：1000)室溫孵育2h，超敏發(fā)光液顯影后使用Tanon5500全自動化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)顯影，并用Quantity One軟件進行灰度分析，以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白條帶灰度的比值作為目的蛋白的相對表達水平。實驗重復3次。

1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析，多組間計量資料的比較采用單因素方差分析法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度17-AAG對人絨毛膜癌JAR細胞增殖的影響MTT結(jié)果顯示，17-AAG對人絨毛膜癌JAR細胞生長具有明顯的抑制作用，隨著17-AAG濃度的升高，JAR細胞的增殖抑制率逐漸升高（P＜0.05，圖1）。藥物作用48h細胞增殖抑制率IC50均值為5.736。

圖1 不同濃度17-AAG對JAR細胞的抑制作用

2.2 不同濃度17-AAG對JAR細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達的影響 分別用5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、40μg/ml的17-AAG處理細胞24h，與對照組（0μg/ml）相比，各實驗組細胞MMP-2和MMP-9蛋白的表達明顯降低，隨著17-AAG濃度的升高，MMP-2和MMP-9蛋白的表達逐漸降低（P＜0.05，圖2）。

圖2 不同濃度17-AAG對JAR細胞MMP-2、MMP-9蛋白表達的影響

3 討論

基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）的主要功能是降解細胞外基質(zhì)、維持細胞外基質(zhì)的平衡，且在腫瘤細胞的生長、分化、侵襲、轉(zhuǎn)移等過程中起重要作用[6]。MMP-2和MMP-9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。有研究表明[7]，肽酰精氨酸脫亞氨酶1(PAD1)抑制劑通過調(diào)節(jié)MEK1-ERK1/2-MMP-2信號通路發(fā)揮抗人乳腺癌的作用；Liu[8]等研究發(fā)現(xiàn)，姜黃素通過激活miRNA-98抑制MMP-2和MMP-9的表達和活性，從而控制肺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移；Cheng等[9]研究發(fā)現(xiàn)，短指軟珊瑚內(nèi)酯能通過PI3K/AKT/mTOR信號通路下調(diào)MMP-2/-9和尿激酶的表達，從而抑制人膀胱癌細胞的侵襲和遷移；另外，番石榴葉的提取物丁醇成分通過抑制ERK1/2-MAPK信號通路抑制MMP-2和MMP-9的表達，從而抑制肺癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移[10]?？梢?，MMP-2和MMP-9在多種腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。為此本研究觀察了17-AAG對人絨毛膜癌JAR細胞MMP-2和MMP-9蛋白表達的調(diào)控作用，以分析17-AAG對JAR細胞的干預作用及機制。

本研究結(jié)果顯示，17-AAG對人絨毛膜癌JAR細胞的生長具有明顯的抑制作用，且呈濃度依賴性；同時，17-AAG還可以下調(diào)JAR細胞MMP-2和MMP-9的表達，提示17-AAG可能通過降低MMP-2和MMP-9的表達水平，從而抑制JAR細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。由于抗腫瘤細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移是一個多因素參與的復雜體系，17-AAG是通過調(diào)節(jié)MEK1-ERK1/2-MMP-2信號通路還是PI3K/AKT/mTOR信號通路對MMP-2和MMP-9進行調(diào)控，還需進一步的研究探討。

【參考文獻】

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