結(jié)腸癌中ZEB1與LOXL2的表達(dá)及意義

李衛(wèi)奇，賈喜花，王曉博，趙 霞，王靜苗，宋泰寧

（1.承德醫(yī)學(xué)院，河北承德 067000；2.保定市第一中心醫(yī)院）

結(jié)腸癌是癌癥相關(guān)死亡的主要原因之一，90%以上的結(jié)腸癌患者死于局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[1]。因此，深入研究結(jié)腸癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制對(duì)改善患者的總生存期具有重要意義。鋅指E盒同源結(jié)合蛋白-1(zinc finger E box homologous protein-1，ZEB1)是鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子家族的重要成員，其兩側(cè)的鋅指簇能與特定核苷酸序列結(jié)合，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[2]。賴氨酰氧化酶-2(lysyloxidase-2，LOXL2)是賴氨酰氧化酶家族的成員之一，可催化特定賴氨酸殘基中的氨基集團(tuán)的氧化脫酰胺基作用區(qū)域，導(dǎo)致彈性和膠原蛋

白的共價(jià)交聯(lián)，進(jìn)而增加基質(zhì)剛度，促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲[3]。目前，在結(jié)腸癌中ZEB1及LOXL2相互作用的研究較少。本研究采用免疫組化MaxVision法檢測(cè)了ZEB1和LOXL2在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況，并分析了二者與結(jié)腸臨床病理征的關(guān)系，以及結(jié)腸癌中二者表達(dá)的相關(guān)性，進(jìn)一步探究了ZEB1和LOXL2在結(jié)腸癌浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移過程中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取保定市第一中心醫(yī)院2015年1月至2016年12月經(jīng)手術(shù)切除且病理診斷為結(jié)腸腺癌的組織蠟塊72例，患者手術(shù)前均未接受任何抗腫瘤治療。其中包括男38例、女34例；年齡28～82歲(中位年齡56歲)；高分化26例、中分化31例、低分化15例；浸潤(rùn)深度T1-T234例，T3-T438例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性33例，陰性39例；采用2010年AJCC(美國(guó)聯(lián)合癌癥分類委員會(huì))和UICC(國(guó)際抗癌聯(lián)盟)修定的TNM分期：Ⅰ-Ⅱ期40例、Ⅲ-Ⅳ期32例。另取36例癌旁組織(距腫瘤邊緣＞5cm)為對(duì)照組，經(jīng)病理切片檢查證實(shí)為正常組織，包括男19例、女17例，年齡28～79歲(中位年齡56歲)。

1.2 試劑和方法 免疫組化采用MaxVision法。兔抗人ZEB1多克隆抗體購自美國(guó)Santa Cruz公司，兔抗人LOXL2單克隆抗體購自美國(guó)SAB公司；通用免疫組織化學(xué)MaxVision試劑盒和DAB顯色試劑，購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司。ZEB1抗體、LOXL2抗體工作濃度1：100，具體染色步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。以已知陽性組織切片作陽性對(duì)照，以PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3 結(jié)果判定 ZEB1和LOXL2陽性表達(dá)產(chǎn)物為棕黃色顆粒，分別定位于細(xì)胞核和細(xì)胞漿。所有切片均由兩位病理科醫(yī)師在雙盲情況下進(jìn)行計(jì)分。ZEB1［4］：＞25%的細(xì)胞細(xì)胞核著色為陽性。LOXL2按照半定量積分法［5］：①每例標(biāo)本隨機(jī)觀察10個(gè)(×400倍)高倍視野，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的百分比，陽性細(xì)胞百分率＜5%、10%～25%、25%～50%、＞50%分別計(jì)0、1、2、3分；②觀察染色強(qiáng)度，未著色、淺黃色、棕黃色、棕褐色分別計(jì)0、1、2、3分；以①×②判定LOXL2的染色結(jié)果，0～3分為陰性，3分以上為陽性。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)數(shù)資料采用卡方檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ZEB1和LOXL2在結(jié)腸癌中的表達(dá) ZEB1和LOXL2在結(jié)腸癌組織中的陽性表達(dá)率分別為29.2%(21/72)和75.0%(54/72)，均明顯高于癌旁組織[ZEB1 0%(0/36)，LOXL2 13.9%(5/36)]，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

2.2 ZEB1、LOXL2表達(dá)與結(jié)腸癌臨床特征的關(guān)系 結(jié)腸癌組織ZEB1和LOXL2表達(dá)與性別、年齡和分化程度無關(guān)(P＞0.05)；與TNM分期、浸潤(rùn)深度和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P＜0.05)：ZEB1和LOXL2陽性表達(dá)率均為TNM分期Ⅲ-Ⅳ期明顯高于Ⅰ-Ⅱ期，浸潤(rùn)深度T3-T4明顯高于T1-T2，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移。見表1：

表1 ZEB1和LOXL2表達(dá)與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 結(jié)腸癌ZEB1和LOXL2表達(dá)的相關(guān)性 結(jié)腸癌組織中，ZEB1和LOXL2的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系(r＝0.30，P＜0.05)。見表2：

3 討論

ZEB1是E盒綁定蛋白家族中的重要成員，基因主要位于人類10號(hào)染色體上，可以調(diào)節(jié)包括波形蛋白及E-cad在內(nèi)的多種基因轉(zhuǎn)錄，從而調(diào)節(jié)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，對(duì)腫瘤的侵襲遷移起重要作用[2，6-7]。近年來研究顯示，ZEB1在胃癌[8]、胰腺癌[9]及肺癌[10]等多種腫瘤中過表達(dá)，并與腫瘤的局部浸潤(rùn)與遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織ZEB1的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁正常組織；進(jìn)一步分析ZEB1與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系，ZEB1表達(dá)與浸潤(rùn)深度(T1-T214.7% vs T3-T442.1%)、TNM分期(Ⅰ-Ⅱ 12.5% vs Ⅲ-Ⅳ 50%)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(無17.9%vs有42.4%)有關(guān)，提示ZEB1在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展及遷移侵襲中起重要作用。

LOXL2是賴氨酰氧化酶家族的一員，基因位于人染色體8p21.2-p23.3，可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)重塑，參與腫瘤血管生成，誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化，最終導(dǎo)致腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移[3，11]。近年來研究發(fā)現(xiàn)，LOXL2在胃癌[12]、食管癌[13]及肝癌[14]等多種惡性腫瘤中過表達(dá)，并且升高的LOXL2與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移及生存期短相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織LOXL2的陽性表達(dá)率明顯高于癌旁組織，提示LOXL2與結(jié)腸癌的發(fā)生有關(guān)；進(jìn)一步分析LOXL2與結(jié)腸癌臨床病理特征的關(guān)系，LOXL2表達(dá)與TNM分期(Ⅲ-Ⅳ90.6% vsⅠ-Ⅱ 62.5%)、浸潤(rùn)深度(T3-T486.8% vs T1-T261.8%)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(有87.9%vs無64.1%)有關(guān)，提示LOXL2可能參與了結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移過程。

有研究顯示，ZEB1可與LOXL2啟動(dòng)子區(qū)域直接結(jié)合，增加LOXL2的表達(dá)，進(jìn)而引起微環(huán)境中膠原的沉積和交聯(lián)，最終導(dǎo)致腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[10]。本研究結(jié)果顯示，結(jié)腸癌組織ZEB1與LOXL2的表達(dá)呈正相關(guān)關(guān)系，提示在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移過程中二者可能具有協(xié)同作用。

綜上所述，ZEB1和LOXL2在結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展和侵襲轉(zhuǎn)移中可能存在相互作用，聯(lián)合檢測(cè)ZEB1和LOXL2可能對(duì)判定結(jié)腸癌的侵襲轉(zhuǎn)移具有一定的臨床價(jià)值。

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