F3′5′H對馬鈴薯花青素合成的調(diào)控

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(1. 山東師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院， 山東 濟(jì)南 250014； 2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 a.蔬菜花卉研究所/山東省設(shè)施蔬菜生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/國家蔬菜改良中心山東分中心，b.生物技術(shù)研究中心， 山東 濟(jì)南 250100)

花青素(anthocyanin)又名花色素，屬類黃酮化合物，具有較好的水溶性，是植物的根莖、果實(shí)和花瓣等的主要顯色物質(zhì)。迄今為止，科技人員已發(fā)現(xiàn)50多種花青素，植物中常見的花青素有6 種，如矮牽牛色素(petunidin)、翠雀素或飛燕草色素(delphindin)、矢車菊色素(cyanidin)、 天竺葵色素(pelargonidin)、 芍藥色素(peonidin)和錦葵色素(malvidin)。 在自然界中， 花青素通常與各種單糖化合形成糖苷， 并以糖苷化合物的形式存在， 單獨(dú)以游離狀態(tài)形式存在的花青素極少[1]。 花青素具有殺菌、 清除氧自由基、 抗衰老以及降低心腦血管、 癌癥和糖尿病等疾病的發(fā)病概率等功效[2]， 因此， 花青素在食品保健和醫(yī)藥等領(lǐng)域具有重要的價(jià)值， 受到科技工作者高度關(guān)注[3-5]。

馬鈴薯(SolanumtuberosumL.)是我國第五大糧食作物，營養(yǎng)豐富，享有“地下蘋果”美譽(yù)。與普通栽培的馬鈴薯相比，紫色和紅色馬鈴薯除富含淀粉、維生素以及人體必需的23種氨基酸以外，還含有大量的花青素[6]。馬鈴薯中的花青素對健康有很多益處。通過對小鼠的研究表明，馬鈴薯中的花青素能夠顯著提高超氧化物歧化酶的活性和抗氧化能力，從而使身體免受傷害[7-8]。近年來，隨著人們對富含花青素馬鈴薯認(rèn)識的提高，馬鈴薯花青素生物合成研究受到科研人員的重視，成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[9-10]。

在馬鈴薯花青素的合成研究中，花青素的合成途徑已基本明確(圖1)，其生物合成不僅受類黃酮3′, 5′羥化酶基因F3′5′H、 二氫黃酮醇-4-還原酶基因DFR、 查爾酮合酶基因CHS(CHSJ和CHSG)、 查爾酮異構(gòu)酶基因CHI、 類黃酮3羥化酶基因F3H和類黃酮-3-O-葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶基因3GT等結(jié)構(gòu)基因的控制[10]， 而且還受到R2R3 MYB、 類似于MYC的螺旋-環(huán)-螺旋的bHLH和WD40重復(fù)蛋白等轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控[11-12]。F3′5′H編碼類黃酮3′,5′羥化酶，該酶屬于細(xì)胞色素P-450總科，主要催化二氫黃酮醇在3′、 5′位置上各氧化上一個羥基[13]。在馬鈴薯中，F(xiàn)3′5′H控制矮牽牛色素類型的紫色或藍(lán)色花青素的的合成[14-15]。R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子是含有2個MYB結(jié)構(gòu)域的MYB蛋白[16]，在馬鈴薯中已經(jīng)克隆了R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子AN1，它通過激活DFR、F3′5′H等結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)來促進(jìn)花青素的合成[11]。bHLH轉(zhuǎn)錄因子屬于MYC轉(zhuǎn)錄因子，StbHLH1已經(jīng)定位到馬鈴薯的9號染色體上，并且發(fā)現(xiàn)它能夠增強(qiáng)花青素的合成[10,12]。WD40重復(fù)蛋白具有β螺旋槳蛋白組結(jié)構(gòu)，已經(jīng)從馬鈴薯Chieftain中克隆出WD40重復(fù)蛋白基因StAN11(HQ599506)，它可以明顯上調(diào)DFR的表達(dá)量使塊莖的紅色加深[17]。 此外， MYB、 bHLH和WD40可以形成MYB-bHLH-WD40(MBW)復(fù)合體調(diào)節(jié)花青素的合成。MYB提供脫氧核糖核酸(DNA)的特殊連接結(jié)構(gòu)域，bHLH在一定程度上決定著激活基因的種類，WD40在總體上調(diào)控這3種轉(zhuǎn)錄因子形成的復(fù)合體MBW[18]。

圖1 馬鈴薯花青素合成途徑

當(dāng)前， 盡管馬鈴薯花青素的合成途徑已基本清晰， 但是對不同花青素之間生物合成流向的研究較少。 研究花青素流向機(jī)制對豐富花青素的合成途徑具有重要意義， 因此， 本文中利用紫色馬鈴薯及其紅色突變體為材料， 對馬鈴薯紫色花青素和紅色花青素之間的轉(zhuǎn)化調(diào)節(jié)進(jìn)行研究， 以期豐富花青素的代謝途徑， 并為富含花青素馬鈴薯的育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

馬鈴薯四倍體材料SD92，俗稱黑金剛，紫色薯皮和薯肉。SD140是由SD92切片再生的突變體，紅色薯皮和薯肉。SD92和SD140種植于溫室70 d收獲，收獲后的塊莖洗凈后用吸水紙干燥，迅速切成片后用液氮速凍，置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 供試方法

1.2.1 核糖核酸提取和互補(bǔ)脫氧核糖核酸的合成

采用改良的Trizol法提取核糖核酸(RNA)， 具體步驟如下： 1)取0.1 g材料加入液氮研磨， 然后加入1 mL Trizol和2 μL β-巰基乙醇混勻，室溫放置10 min，4 ℃， 以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心分離10 min； 2)取上清于1.5 mL離心管中， 加入200 μL氯仿， 室溫放置10 min，4 ℃，以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心分離10 min；3)取上清于1.5 mL離心管中，加入1/4體積的氯仿和等體積的1.5%十六烷基三甲基溴化銨+15%醋酸鉀混合液后顛倒混勻，室溫放置10 min，以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心分離10 min；4)取上清， 加入等體積的異丙醇， 顛倒混勻， 室溫放置10 min， 以12 000 r/min轉(zhuǎn)速離心分離10 min； 5)棄上清， 加入1 mL的75%預(yù)冷乙醇短暫離心分離，洗滌沉淀，室溫晾干；6)干燥后用20 μL 焦磷酸二乙酯-水溶解，-80 ℃保存。140 V電泳15 min，凝膠電泳檢測RNA的完整性，利用Implen P330 (Germany)測定RNA的質(zhì)量和濃度。

采用DNase I(Thermo，USA)對提取的RNA消化，降解殘留的DNA，具體步驟參照說明，并用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測消化結(jié)果。取1 μL消化完全的RNA為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到互補(bǔ)脫氧核糖核酸(cDNA)，反轉(zhuǎn)錄采用PrimeScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(TaKaRa)，具體步驟參照試劑盒說明。

1.2.2 基因檢測及分析

F3′5′H基因的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測：以馬鈴薯延伸因子基因EF1-α(AB061263.1)作為內(nèi)參基因[19]，檢測F3′5′H[AY675558(PGSC0003DMT400001124)]的表達(dá)。首先參照AB061263.1和AY675558序列，利用Primer5.0設(shè)計(jì)特異性引物(表1)， 以1 μL反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)。 PCR 程序?yàn)椋?95 ℃預(yù)變性 3 min； 95 ℃變性 30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸 2 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。

采用熒光定量方法對F3′5′H和轉(zhuǎn)錄因子基因MYB、MYC、WD40的表達(dá)量進(jìn)行分析。首先根據(jù)F3′5′H[AY675558(PGSC0003DMT400001124)]、MYB[NM_001288222 (PGSC0003DMT400022661)]、MYC[XM_006366182(PGSC0003DMT400002963)]、WD40 [HQ599506]序列設(shè)計(jì)特異性的熒光定量PCR引物(表1)，然后進(jìn)行實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)。參照Glais L和侯志強(qiáng)對馬鈴薯實(shí)時熒光定量中內(nèi)參基因選擇的研究結(jié)果[20-21]，選擇18S核糖體核糖核酸(rRNA)為內(nèi)參基因。qRT-PCR反應(yīng)體系為50 μL，其中25 μL超級熒光染料SYBR混合液(CWBIO)、1 μL的cDNA、1 μL濃度為10 μmol/L的正向引物、1 μL濃度為10 μmol/L的反向引物、22 μL的二次蒸餾水。qRT-PCR反應(yīng)在iCycler iQ(Bio-Rad， Hercules，CA，USA)中進(jìn)行，程序?yàn)?5 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火/延伸1 min，37 個循環(huán)， 3次重復(fù)。 采用EXCEL2007對兩種材料中的基因熒光定量數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異檢驗(yàn)。

表1 實(shí)驗(yàn)所用引物

1.2.3F3′5′H編碼區(qū)序列及啟動子序列測序及分析

以SD92和SD140 DNA為模板， 用高保真聚合酶Trans Taq DNA Polymerase High Fidelity(HiFi)， 參考馬鈴薯基因F3′5′H的DNA序列AB496976.1和 PGSC0003DMG400000425 設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增F3′5′H編碼區(qū)； 參考PGSC0003DMG400000425(http://solanaceae.plantbiology.msu.edu/cgi-bin/gbrowse/potato/#search)前面2 000 bp序列設(shè)計(jì)特異性引物(表1)擴(kuò)增啟動子序列。以SD92的cDNA為模板，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳檢測，用PCR回收試劑盒(Biomiga)回收純化PCR產(chǎn)物，回收后的產(chǎn)物與 PMD18-T(Takara)重組，然后將重組載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)菌液 PCR 鑒定為陽性的樣品送到上海生工生物科技有限公司測序驗(yàn)證。測序結(jié)果用DNAMAN軟件進(jìn)行比對，分析F3′5′H的編碼區(qū)序列和啟動子序列。啟動子序列用植物順式元件數(shù)據(jù)庫Plant-CARE(plant cis-acting regulatory element，http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)在線預(yù)測分析啟動子可能存在的順式作用元件。

2 結(jié)果與分析

2.1 RNA的提取結(jié)果

利用改良Trizol法提取的總RNA無彌散帶，18S、28S和5S條帶清晰，表明總RNA完整未降解(圖2)。SD92和SD140這2種材料提取的RNA濃度較高，質(zhì)量濃度分別為410、524 mg/L；兩者在波長為260 nm的吸光度A260與280 nm的吸光度A280之比以及260 nm的吸光度A260與230 nm的吸光度A230之比均大于2.0(見表2)，表明RNA質(zhì)量良好，可以用于后續(xù)熒光定量分析。

圖2 提取核糖核酸完整性檢測表2 提取的核糖核酸的品質(zhì)及濃度

材料名稱質(zhì)量濃度/(mg·L-1)A260/A280A260/A230SD924102.052.01SD1405242.052.05 注:A230、A260、A280分別為材料在波長為230、260、280nm時的吸光度值。

2.2 F3′5′H的表達(dá)量分析

利用反轉(zhuǎn)錄后的cDNA，在SD140和SD92中進(jìn)行類黃酮3′, 5′羥化酶基因F3′5′H的RT-PCR和qRT-PCR檢測，結(jié)果見圖3。從圖中可以看出，通過RT-PCR檢測，F(xiàn)3′5′H在SD140中表達(dá)量較低，在SD92中表達(dá)量較高。熒光定量PCR結(jié)果見圖4?？梢钥闯?，F(xiàn)3′5′H在SD140中的表達(dá)量僅為SD92的40%，兩者的差異達(dá)到顯著水平。

2.3 F3′5′H編碼區(qū)序列及啟動子序列測定及序列分析

鑒于F3′5′H在SD92和SD140的表達(dá)量不同，對DNA序列和啟動子區(qū)域進(jìn)行測序，結(jié)果顯示SD92和SD140具有相同的F3′5′H編碼區(qū)序列和啟動子序列(圖5)。編碼區(qū)序列有2 882 bp，與AB496976.1的同源性達(dá)到95%。F3′5′H編碼區(qū)序列中有1 530 bp的編碼序列，編碼509個氨基酸殘基。啟動子序列有1 200 bp，為研究調(diào)控元件對花青素轉(zhuǎn)化的影響，對F3′5′H啟動子進(jìn)行了分析。定義轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)(TSS)的第一個堿基為+1，將克隆的1 200 bp的序列進(jìn)行在線預(yù)測，結(jié)果(圖5)顯示F3′5′H啟動子不僅含有真核生物啟動子必須的核心元件TATA-box，還含有其他調(diào)控元件，主要有：1)激素應(yīng)答元件， 如ABRE(脫落酸響應(yīng)元件)、 ERE(乙烯響應(yīng)元件)、 TATC-box(赤霉素響應(yīng)元件)、 TCA-element(水楊酸響應(yīng)元件)； 2)光響應(yīng)元件， 如Box 4、 Box I、G-Box、 LS7、 chs-CMA1a等； 3)脅迫應(yīng)答元件, 如HSE(熱脅迫)、 TC-rich repeats(干旱脅迫以及病蟲害脅迫)； 4)結(jié)合位點(diǎn)， MBS(MYB結(jié)合位點(diǎn))。

圖3 F3′5′H的反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測

圖4 F3′5′H的實(shí)時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測

2.4 轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量的分析

花青素的合成路徑受轉(zhuǎn)錄因子的影響，實(shí)驗(yàn)中通過對F3′5′H啟動子序列的分析也發(fā)現(xiàn)該啟動子區(qū)域具有轉(zhuǎn)錄因子MYB結(jié)合位點(diǎn)， 基于花青素合成路徑中MYB轉(zhuǎn)錄因子與MYC、 WD40有密切的聯(lián)系， 分別對SD92和SD140的MYB、MYC、WD40的表達(dá)量進(jìn)行差異分析。熒光定量PCR檢測結(jié)果表明，這3種轉(zhuǎn)錄因子在SD92和SD140中的表達(dá)量不同，兩者的差異達(dá)到顯著水平。MYB、MYC和WD40在SD140中的表達(dá)量明顯高于SD92，分別是SD92的5.03、 3.97、 3.71倍(圖6)。

圖5 F3′5′H編碼區(qū)序列及啟動子的序列分析(加粗部分為編碼序列，斜體部分為非編碼序列)

(a) MYB

(b) MYC

(c) WD40圖6 SD140和SD92中轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)量分析

3 討論與結(jié)論

在本實(shí)驗(yàn)中， SD92突變生成SD140， 馬鈴薯塊莖的皮色和肉色由紫色轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色。 在這一變化過程中， 紫色的花青素轉(zhuǎn)化成紅色的花青素。 紫色花青素的合成主要受F3′5′H控制[13]，F(xiàn)3′5′H是控制花青素合成向不同支路發(fā)展的重要開關(guān)[22]。 實(shí)驗(yàn)中F3′5′H的表達(dá)量在SD140中明顯降低， 表明馬鈴薯紫色花青素向紅色花青素的轉(zhuǎn)化很可能是由F3′5′H表達(dá)量的下降引起的。

早期的研究結(jié)果表明，在F3′5′H編碼區(qū)序列中插入轉(zhuǎn)座子dTstu1可以引起F3′5′H表達(dá)量下降[15]。然而，在本實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)3′5′H在2種材料中的編碼區(qū)序列及啟動子區(qū)域沒有差異，說明花青素由紫色向紅色的轉(zhuǎn)化不是由于基因序列的不同引起的，可能是由于調(diào)控F3′5′H的轉(zhuǎn)錄因子變化引起的。轉(zhuǎn)錄因子BrMYB和SmMYB可以正向地調(diào)控花青素結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)[23-24]，MYB因子CAPRICE也可以通過抑制PAL、CHS、DFR和ANS等結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)來抑制花青素的合成[25]。本實(shí)驗(yàn)中，F(xiàn)3′5′H啟動子區(qū)序列分析結(jié)果表明啟動子區(qū)域有MYB結(jié)合位點(diǎn)，且MYB(PGSC0003DMT400022661)在紅色突變體中表達(dá)量提高，說明該MYB轉(zhuǎn)錄因子可能抑制了F3′5′H的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)馬鈴薯從紫色花青素轉(zhuǎn)化為紅色花青素。

在調(diào)控花青素合成中，MYB與bHLH或者WD40或者三者形成MBW復(fù)合體調(diào)控花青素的合成[26]。MYB與MYC轉(zhuǎn)錄因子bHLH1具有連接活性，它們一起調(diào)節(jié)花青素合成晚期基因的表達(dá)[27]。在馬鈴薯塊莖中克隆到的R2R3MYB轉(zhuǎn)錄因子有共表達(dá)因子StbHLH1，它在細(xì)胞核中表達(dá)，增強(qiáng)了MYB對花青素合成的調(diào)節(jié)效果[10,12]。本實(shí)驗(yàn)中，相對于紫色馬鈴薯SD92，MYC(XM_006366182)在紅色突變體SD140中表達(dá)量明顯提高，說明MYC通過增強(qiáng)MYB的作用促進(jìn)了馬鈴薯紫色花青素向紅色花青素的轉(zhuǎn)化。此外，已經(jīng)在馬鈴薯中克隆的WD40 重復(fù)蛋白基因StAN11能夠增強(qiáng)紅色花青素的合成[17]。在紫色馬鈴薯SD92突變?yōu)榧t色馬鈴薯SD140的過程中，WD40(HQ599506)的表達(dá)量提高了，說明它促進(jìn)紅色花青素的合成，這與前人的研究結(jié)果是一致的。由于在馬鈴薯中的MBW復(fù)合體能夠加強(qiáng)MYB對花青素合成的調(diào)節(jié)作用[28]，因此WD40可能通過MBW復(fù)合體增強(qiáng)MYB對紅色花青素合成的流向調(diào)控。

總之，F(xiàn)3′5′H是馬鈴薯塊莖花青素向紅色或紫色合成的重要基因。MYB、 MYC和WD40這3個轉(zhuǎn)錄因子可能通過抑制F3′5′H的表達(dá)進(jìn)而調(diào)控馬鈴薯紫色花青素的合成轉(zhuǎn)向紅色花青素的合成。MYB和MYC、WD40的功能及之間如何相互作用需要進(jìn)一步的研究。

參考文獻(xiàn):

[1] MARTIN C, GERATS T. Control of pigment biosynthesis genes during petal development[J]. Plant Cell, 1993, 5(10): 1253-1264.

[2] TSUDA T. Dietary anthocyanin-rich plants： biochemical basis and recent progress in health benefits studies[J].Mol Nutr Food Res, 2012, 56(1): 159-170.

[3] JEZEK M, Z?RB C, MERKT N, et al. Anthocyanin management in fruits by fertilization[J].J Agr Food Chem, 2018[2018-01-10].http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/acs.jafc.7b03813.doi: 10.1021/acs.jafc.7b03813.

[4] ZHANG Y, BUTELLI E, MARTIN C. Engineering anthocyanin biosynthesis in plants[J]. Curr Opin Plant Biol, 2014, 19: 81-90.

[5] ZHA J, KOFFAS M A G. Synthetic production of anthocyanins in metabolically engineered microorganisms: current status and perspectives[J].Synthetic and Systems Biotechnology, 2017, 2(4): 259-266.

[6] BROWN C R, CULLEY D, BONIERBALE M, et al. Anthocyanin, carotenoid content and antioxidant values in native South American potato cultivars[J].HortScience, 2007, 42(7): 1733-1736.

[7] HAN KH, SEKIKAWA M, SHIMADA K, et al. Anthocyanin-rich purple potato flake extract has antioxidant capacity and improves antioxidant potential in rats[J]. Br J Nutr. 2006, 96(6): 1125-1133.

[8] HAN KH, HASHIMOTO N, HASHIMOTO M, et al. Red potato extract protect from D-galactosamine-induced liver injury rats[J]. Biosci Biotechnol Biochem, 2006, 70(9): 2285-2288.

[9] LIU Y H, WANG K L, DENG C, et al. Comparative transcriptome analysis of white and purple potato to identify genes involved in anthocyanin biosynthesis[J].PLoS ONE, 2015, 7.[2017-05-17].https://doi:10.1371/journal.pone.0129148.

[10] LU Q N, YANG Q. cDNA cloning and expression of anthocyanin biosynthetic genes in wild potato (Solanumpinnatisectum)[J].Afr J Biotechnol, 2006, 5(10): 811-818.

[11] D′AMELIA V, AVERSANO R, BATELLI G, et al. High AN1 variability and interaction with basic helix-loop-helix co-factors related to anthocyanin biosynthesis in potato leaves[J].Plant J, 2014, 80(3): 527-540.

[12] ZHANG Y F, JUNG C S, DE JONG W S. Genetic analysis of pigmented tuber flesh in potato[J]. Theor Appl Genet, 2009, 119(1): 143-150.

[13] HOLTON T A, CORNISH E C. Genetics and biochemistry of anthocyanin biosynthesis[J]. Plant Cell, 1995, 7(7): 1071-1083.

[14] JUNG C S, GRIFFITHS H M, DE JONG M D, et al. The potato P locus codes for flavonoid 3′,5′-hydroxylase[J]. Theor Appl Genet, 2005, 110(2): 269-275.

[15] MOMOSE M, ABE Y, OZEKI Y. Miniature inverted-repeat transposable elements of stowaway are active in potato[J].Genetics, 2010, 186(1): 59-66.

[16] STRACKE R, WERBER M, WEISSHAAR B. TheR2R3-MYBgene family inArabidopsisthaliana[J]. Plant Biol, 2001, 4(5): 447-456.

[17] LI W, WANG B, WANG M, et al. Cloning and characterization of a potato StAN11 gene involved in anthocyanin biosynthesis regulation[J].J Integr Plant Biol, 2014, 56(4): 364-372.

[18] HICHRI I, HEPPEL S C, PILLET J, et al. The basic helix-loop-helix transcription factor MYC1 is involved in the regulation of the flavonoid biosynthesis pathway in grapevine[J]. Mol Plant, 2010, 3(3): 509-523.

[19] 董玉梅, 密其鵬, 焦自高, 等.馬鈴薯GLDH基因的克隆及序列分析[J].園藝學(xué)報(bào), 2011, 38(6): 1111-1120.

[20] GLAIS L, KERLAN C, TRIBODET M, et al. Molecular characterization of potato virus YNisolates by PCR-RFLP[J].Eur J Plant Pathol, 1996, 102(7): 655-662.

[21] 侯志強(qiáng), 王慶國. 鮮切馬鈴薯實(shí)時熒光定量PCR分析中內(nèi)參基因的選擇[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué), 2013, 41(12): 5207-5209.

[22] SHIMADA Y, OHBAYASHI M, NAKANO-SHIMADA R, et al. Genetic engineering of the anthocyanin biosynthetic pathway with flavonoid-3′,5′-hydroxylase: specific switching of the pathway in petunia[J].Plant Cell Rep, 2001, 20(5): 456-462.

[23] ZHANG Y G, CHEN G P, DONG T T, et al. Anthocyanin accumulation and transcriptional regulation of anthocyanin biosynthesis in purple bok choy(Brassicarapavar.chinensis)[J].J Agr Food Chem, 2014, 62(51): 12366-12376.

[24] ZHANG Y G, HU Z L, CHU G H, et al. Anthocyanin accumulation and molecular analysis of anthocyanin biosynthesis-associated genes in eggplant(SolanummelongenaL.)[J].J Agr Food Chem, 2014, 62(13): 2906-2912.

[25] WADA T, KUNIHIRO A, TOMINAGA-WADA R. Arabidopsis CAPRICE(MYB)and GLABRA3 (bHLH)control tomato (Solanumlycopersicum) anthocyanin biosynthesis[J].PLoS One, 2014, 9.[2018-01-20]. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0109093.

[26] SHIN D H, CHO M, CHOI M G, et al. Identification of genes that may regulate the expression of the transcription factor production of anthocyanin pigment 1(PAP1)/MYB75 involved in Arabidopsis anthocyanin biosynthesis[J].Plant Cell Rep, 2015, 34(5): 805-815.

[27] CHIU L W, LI L. Characterization of the regulatory network of BoMYB2 in controlling anthocyanin biosynthesis in purple cauliflower[J]. Planta, 2012, 236(4): 1153-1164.

[28] FOGELMAN E, TANAMI S, GINZBERG I. Anthocyanin synthesis in native and wound periderms of potato[J]. Physiol Plantarum, 2015, 153(4): 616-626.