燕麥低聚肽對(duì)糖尿病大鼠血糖的影響

劉欣然，劉思奇，侯 超，烏 蘭，毛瑞雪，麻慧娟，李 勇，王軍波

(北京大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生學(xué)系，北京 100191)

研究表明，燕麥具有降血糖的作用[1-4]。2014年，Bao等[5]納入15項(xiàng)隨機(jī)對(duì)照研究(來(lái)自美國(guó)、加拿大、歐洲人群)進(jìn)行系統(tǒng)評(píng)價(jià)，結(jié)果顯示，與小麥等食物相比，每天攝入3mg以上燕麥β-葡聚糖(相當(dāng)于60g以上燕麥)持續(xù)8w以上可明顯降低空腹胰島素濃度，并可降低空腹血糖及糖化血紅蛋白水平。朱萍等[6]對(duì)80例老年2型糖尿病人的研究顯示，給予8w的燕麥治療可以顯著降低患者的餐后血糖水平，在血糖控制良好的基礎(chǔ)上，對(duì)保護(hù)胰島功能有一定的作用。目前針對(duì)燕麥功能成分的研究多局限于燕麥β-葡聚糖，近年來(lái)，人們發(fā)現(xiàn)生物活性肽具有諸多顯著的生理功能活性[7-9]，也是優(yōu)質(zhì)的燕麥低聚肽制備原料。本研究的主要目的旨在初探燕麥低聚肽對(duì)糖尿病的輔助治療作用，同時(shí)還將探究燕麥低聚肽對(duì)于糖尿病并發(fā)的血脂代謝紊亂是否有調(diào)節(jié)作用。

1 材料及方法

1.1 受試物

燕麥低聚肽(Oat oligopeptides，OOPs)，是利用酶解技術(shù)從燕麥麩皮中得到的小分子生物活性肽的混合物，來(lái)自內(nèi)蒙古三主糧集團(tuán)股份公司。經(jīng)L8900-全自動(dòng)氨基酸分析儀(日立高新技術(shù)有限公司)檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)氨基酸總量占67.8%，其中谷氨酸較多(表1)。經(jīng)高效液相色譜純化分離后，分析其分子質(zhì)量分布可知，主要以小分子低聚肽為主，相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000D的成分占92.05%、1 000～2 000D的成分占5.13%、>2 000D的成分占2.82%。

表1 燕麥低聚肽中氨基酸組成及含量

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)條件

1.2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及飼養(yǎng)環(huán)境 健康SPF級(jí)雄性SD大鼠90只，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)部提供，生產(chǎn)合格證號(hào)[SCXK(京)2016—0010]，使用許可證號(hào)SYXK(京)2016—0041，體重200±20g。分籠飼養(yǎng)，每籠2只，飼養(yǎng)環(huán)境符合屏障環(huán)境，溫度范圍25±1℃，相對(duì)濕度50%～60%RH，室內(nèi)照明控制在12 h/12 h光暗周期節(jié)律。動(dòng)物喂養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)嚴(yán)格按照《北京市實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》執(zhí)行，并經(jīng)過(guò)北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部倫理委員會(huì)審核通過(guò)(批準(zhǔn)號(hào)：LA2017189)。

1.2.2 高熱能飼料 豬油10%、蔗糖15%、蛋黃粉15%、酪蛋白5%、膽固醇1.2%、膽酸鈉0.2%、碳酸氫鈣0.6%、石粉0.4%、鼠維持料52.6%。配方來(lái)源為保健食品輔助降血糖功能評(píng)價(jià)方法(國(guó)食藥監(jiān)保化[2012]107號(hào))，由北京科澳協(xié)力飼料有限公司提供，飼料合格證號(hào)：No.11002900030558，許可證號(hào)：SCXK(京)2014—0010。

1.2.3 對(duì)照飼料 維持飼料，北京科澳協(xié)力飼料有限公司，營(yíng)養(yǎng)成分及水平符合GB 14924.3—2010。

1.3 主要試劑及儀器

本研究用到的主要儀器與試劑見(jiàn)表2及表3。

表2 主要儀器

表3 主要試劑

注：其他試劑均為分析純

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 糖尿病模型大鼠降血糖實(shí)驗(yàn) (1)糖尿病大鼠模型的建立：隨機(jī)選取78只健康成年SD雄性大鼠，普通維持料適應(yīng)性飼養(yǎng)7d，隨后在高熱能飼料喂養(yǎng)45d后腹腔注射低劑量STZ(30mg/kg)2次，兩次注射時(shí)間間隔6d。末次注射3d后禁食5h，通過(guò)尾尖采血測(cè)血糖，血糖值在10～25mmol/L之間為糖尿病模型成功動(dòng)物。(2)分組、劑量及給藥方式：實(shí)驗(yàn)所用大鼠共90只，其中78只分為糖尿病模型組進(jìn)行造模、12只為空白對(duì)照組。將造模成功的糖尿病大鼠按空腹血糖和體重水平隨機(jī)分成6組，即1個(gè)糖尿病模型對(duì)照(DM)組、1個(gè)乳清蛋白對(duì)照(WPC)組、1個(gè)二甲雙胍陽(yáng)性對(duì)照(MPC)組和3個(gè)燕麥低聚肽水溶液劑量組(濃度為0.50、1.00、2.00g/kg·BW，分別對(duì)應(yīng)OOP1組、OOP2組、OOP3組)；另12只健康大鼠設(shè)為空白對(duì)照(NC)組。OOPs以蒸餾水配置成水溶液，以灌胃方式(1mL/100g)給予動(dòng)物，DM組給予同體積蒸餾水灌胃，WPC組給予同體積1.0g/kg·BW乳清蛋白水溶液灌胃，MPC組給予同體積鹽酸二甲雙胍水溶液灌胃，初始劑量為50mg/kg·BW，每2w增加50mg/kg·BW，最大劑量為200mg/kg·BW。各組均固定于每日8∶00開始灌胃1次，實(shí)驗(yàn)周期為12w，實(shí)驗(yàn)期間動(dòng)物自由進(jìn)食、飲水。

1.5 檢測(cè)指標(biāo)及方法

1.5.1 一般情況 每日觀察各組大鼠狀態(tài)，定期記錄攝食、飲水量、體重等情況。

1.5.2 血糖及口服糖耐量實(shí)驗(yàn) 干預(yù)第0周、第6周、第8周、第10周及第12周分別取尾靜脈血，用微量血糖儀檢測(cè)空腹血糖。干預(yù)的第4周和第6周進(jìn)行口服糖耐量實(shí)驗(yàn)，具體操作方法為大鼠禁食12h 后，按2g/kg劑量，用50%葡萄糖溶液灌胃，于0、0.5、1、2h 取尾靜脈血用全自動(dòng)生化儀檢測(cè)其血糖水平并計(jì)算血糖曲線下面積。

1.5.3 血脂四項(xiàng)檢測(cè) 于干預(yù)8w末檢測(cè)血脂四項(xiàng)，將大鼠禁食12h取尾靜脈血，離心后用全自動(dòng)生化儀測(cè)血清總膽固醇(TCHO)、甘油三脂(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)。

1.6 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法

2 結(jié)果與分析

2.1 一般情況

共有造模成功的大鼠64只及正常大鼠12只。各組分布為糖尿病模型對(duì)照(DM)組(12只)、乳清蛋白對(duì)照(WPC)組(8只)、二甲雙胍陽(yáng)性對(duì)照(MPC)組(8只)和3個(gè)燕麥低聚肽水溶液劑量組[濃度為0.50、1.00、2.00g/kg·BW，分別對(duì)應(yīng)OOP1組(12只)、OOP2組(12只)、OOP3組(12只)]；12只健康大鼠為空白對(duì)照(NC)組。糖尿病模型組大鼠相比對(duì)照組大鼠毛色暗黃，反應(yīng)遲鈍。如圖1所示，造模前各組大鼠體重?zé)o明顯差別(P>0.05)，造模后各糖尿病模型組大鼠體重均較正常組低，說(shuō)明糖尿病模型組大鼠體重增長(zhǎng)明顯受到抑制。

圖1 OOPs干預(yù)對(duì)糖尿病大鼠體重的影響注：*與DM組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

圖2 OOPs干預(yù)對(duì)大鼠空腹血糖的影響注：*與DM組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05

2.2 OOPs對(duì)糖尿病大鼠空腹血糖的影響

造模前各組大鼠空腹血糖水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，均在正常值范圍，造模后糖尿病模型大鼠各組空腹血糖值均較空白對(duì)照組大鼠明顯升高(P<0.05)(圖2)。隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)，OOPs干預(yù)組大鼠出現(xiàn)了一定程度的血糖下降，尤其以O(shè)OPs最高劑量組OOP3組(2.00g/kg·BW)血糖下降顯著(P<0.05)。自干預(yù)4w后，OOP3組(2.00g/kg·BW OOPs)空腹血糖持續(xù)低于模型對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明2.00g/kg·BW OOPs的持續(xù)干預(yù)可以穩(wěn)定地降低空腹血糖值。同時(shí)，在第6周時(shí)，OOP2組(1.00g/kg·BW OOPs)空腹血糖也顯著低于模型對(duì)照組，提示該劑量的OOPs對(duì)降低大鼠空腹血糖可能也有一定的作用。

2.3 OOPs對(duì)模型大鼠血糖曲線下面積的影響

通過(guò)大鼠口服糖耐量實(shí)驗(yàn)中大鼠口服葡萄糖后0、0.5、1、2h的血糖值計(jì)算曲線下面積(表4)。3個(gè)時(shí)期中，各糖尿病模型組血糖曲線下面積均明顯高于空白對(duì)照組(P<0.05)；在OOPs干預(yù)6w時(shí)，OOP3組和乳清蛋白組大鼠糖耐量曲線下面積明顯低于模型對(duì)照組(P<0.05)；干預(yù)8w時(shí)，OOP3組大鼠血糖曲線下面積仍然顯著低于模型對(duì)照組；干預(yù)15w時(shí)，除OOP2組外，其余各組血糖曲線下面積均低于模型對(duì)照組，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 OOPs對(duì)模型大鼠血脂的影響

對(duì)血清TC水平進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，空白對(duì)照組與各糖尿病模型組間差異有顯著性(P=0.005)，而模型對(duì)照組與燕麥低聚肽干預(yù)組間差異無(wú)顯著性(P=0.945)；血清TG水平呈現(xiàn)非正態(tài)分布，對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，空白對(duì)照組與各糖尿病模型組間差異無(wú)顯著性(P=0.0664)；血清HDL-C水平呈現(xiàn)非正態(tài)分布，對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，空白對(duì)照組與各糖尿病模型組間差異有顯著性(P=0.011)，而模型對(duì)照組與燕麥低聚肽干預(yù)組間差異無(wú)顯著性(P=0.606)；血清LDL-C水平呈現(xiàn)非正態(tài)分布，對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)，空白對(duì)照組與各糖尿病模型組間差異有顯著性(P=0.001)，而模型對(duì)照組與燕麥低聚肽干預(yù)組間差異無(wú)顯著性(P=0.383)。以上血脂四項(xiàng)水平均以中位數(shù)、四分位間距描述(圖3)。

圖3 OOPs干預(yù)8w各組大鼠血脂四項(xiàng)水平[中位數(shù)(四分位數(shù)間距)]注：*與DM組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

表4 OOPs對(duì)糖耐量實(shí)驗(yàn)曲線下面積的影響

注：*與DM組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.05

3 討論

本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)糖尿病模型大鼠采用不同劑量的OOPs水溶液進(jìn)行干預(yù)來(lái)研究OOPs的降血糖作用。近年來(lái)，在糖尿病相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中產(chǎn)生了多種動(dòng)物模型造模方法，考慮到四氧嘧啶易造成肝、腎組織損傷且易發(fā)酮癥導(dǎo)致動(dòng)物死亡，人們逐漸開始用鏈脲佐菌素(STZ)來(lái)破壞胰島β細(xì)胞以達(dá)到模型效果。隨后，人們又提出膳食誘導(dǎo)聯(lián)合小劑量STZ的造模方法[10-15]，主要原理為通過(guò)高熱能飲食誘導(dǎo)和STZ選擇性地?fù)p傷動(dòng)物的胰島β細(xì)胞，造成胰島素抵抗，引起實(shí)驗(yàn)性糖尿病。本研究綜合了多種文獻(xiàn)報(bào)道分析，選擇最優(yōu)造模方案，即高熱能飲食聯(lián)合腹腔注射低劑量STZ的方法實(shí)現(xiàn)，建立最接近人類2型糖尿病特點(diǎn)的動(dòng)物模型，成模率高(82.1%)、動(dòng)物死亡率低、模型持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)，為后續(xù)的研究奠定了基礎(chǔ)。

糖耐量可作為輔助篩查、診斷許多糖尿病并發(fā)癥的重要指標(biāo)[16-17]，糖耐量損傷會(huì)加劇糖尿病的進(jìn)程，曾被報(bào)道是心血管疾病的危險(xiǎn)因素[18]，并且在無(wú)胰島素抵抗的情況下與高甘油三酯血癥的發(fā)生有著明顯關(guān)聯(lián)[19]。因此，改善糖耐量也是防治糖尿病的重要任務(wù)。本研究作為國(guó)內(nèi)外首次探究燕麥低聚肽對(duì)于糖尿病大鼠降糖效果的嘗試，發(fā)現(xiàn)燕麥低聚肽對(duì)于降低糖尿病大鼠空腹血糖以及改善糖耐量均有較好作用。研究中燕麥低聚肽的3個(gè)劑量組以2.00g/kg·BW燕麥低聚肽效果最為顯著，干預(yù)8w時(shí)，該劑量組相較糖尿病模型對(duì)照組的血糖下降率達(dá)到14.3%，相較糖尿病模型對(duì)照組的血糖曲線下面積下降率也達(dá)到了10.8%。此劑量對(duì)應(yīng)的成人等效劑量與Ma X等[20]、毛瑞雪等[21]和李雪等[22]的研究推薦劑量(每日50～100g裸燕麥)較為一致，提示燕麥低聚肽可能是燕麥降血糖作用的主要有效成分之一。

然而，本研究未能發(fā)現(xiàn)燕麥低聚肽對(duì)糖尿病大鼠血脂異?，F(xiàn)象有明顯的改善作用，可能的原因是研究對(duì)象為糖尿病模型大鼠，造模成功后未對(duì)各組間血脂情況進(jìn)行隨機(jī)分布，使得各組間血脂異常程度在干預(yù)前已有所差異；并且在干預(yù)期間持續(xù)的高熱能飼料喂養(yǎng)可能會(huì)對(duì)大鼠血脂調(diào)節(jié)功能影響較為嚴(yán)重，不易恢復(fù)。針對(duì)這個(gè)問(wèn)題可在以后的研究中加以完善，如將血脂情況進(jìn)行分層分析以及利用其他相關(guān)指標(biāo)來(lái)推斷燕麥低聚肽對(duì)于血脂調(diào)節(jié)的影響。

關(guān)于燕麥及燕麥蛋白的一些研究顯示，燕麥蛋白可以提高谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶活性，增加谷胱甘肽的合成，降低細(xì)胞內(nèi)活性氧的產(chǎn)生[23]，提示燕麥低聚肽可能通過(guò)改善機(jī)體氧化應(yīng)激水平來(lái)調(diào)節(jié)血糖并防治并發(fā)癥。其他植物來(lái)源生物活性肽的相關(guān)研究顯示，苦瓜多肽及大豆蛋白活性肽的降血糖作用可能由于對(duì)于小腸黏膜α-葡萄糖苷酶的抑制，減少葡萄糖的吸收[24]。另外，一項(xiàng)針對(duì)燕麥多肽的Caco-2細(xì)胞模型實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，燕麥多肽可下調(diào)二肽基肽酶4抑制劑(DPP4)的表達(dá)，上調(diào)GLP-1相對(duì)表達(dá)量，促進(jìn)α-葡萄糖苷酶、GLUT2和GLUT5相對(duì)表達(dá)量[25]。綜合相關(guān)研究分析，燕麥低聚肽的降血糖作用有可能與上述機(jī)制有關(guān)，需要進(jìn)一步研究。同時(shí)，燕麥低聚肽中有效肽段序列仍未知，需要對(duì)可能的序列進(jìn)一步分析并進(jìn)行體外實(shí)驗(yàn)確認(rèn)。

4 結(jié)論

本研究通過(guò)建立高熱能飼料喂養(yǎng)聯(lián)合小劑量STZ注射誘導(dǎo)的糖尿病癥大鼠模型，設(shè)立空白對(duì)照組、模型對(duì)照組、乳清蛋白對(duì)照組及二甲雙胍對(duì)照組，探討OOPs對(duì)糖尿病大鼠降血糖作用的影響。結(jié)果顯示，燕麥低聚肽具有降低糖尿病大鼠空腹血糖及血糖曲線下面積的作用，這對(duì)于降低糖尿病患者血糖以及防治糖尿病有著重要意義?！?/p>

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