一種對(duì)mcr-1陽性大腸桿菌具有裂解作用的噬菌體生物學(xué)特性

鐘希娜， 何 濤， 葛展霞， 王 冉

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)部食品質(zhì)量安全監(jiān)控重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室/江蘇省禽產(chǎn)品安全性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210014； 2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，江蘇 南京 210095)

大腸埃希氏菌(Escherichiacoli,E.coli)俗稱大腸桿菌，屬于革蘭氏陰性細(xì)菌腸桿菌科埃希氏菌屬。部分致病性的大腸桿菌能同時(shí)感染人畜[1]，給人類健康和財(cái)產(chǎn)造成巨大損失。黏菌素(Colistin)又稱為多黏菌素E(PolymyxinsE)，能破壞革蘭氏陰性細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)[2-3]，中和細(xì)菌內(nèi)毒素[4]，被稱為抵抗革蘭氏陰性菌的最后一道防線[5-7]。長(zhǎng)期以來，黏菌素在國內(nèi)動(dòng)物養(yǎng)殖上應(yīng)用廣泛，導(dǎo)致動(dòng)物源大腸桿菌對(duì)黏菌素的耐藥性逐年增加。最近報(bào)道的大腸桿菌上攜帶的mcr-1基因，可以介導(dǎo)大腸桿菌對(duì)黏菌素的低水平耐藥。值得注意的是，該耐藥基因可以通過質(zhì)粒在同一細(xì)菌種屬甚至不同細(xì)菌種屬間進(jìn)行水平傳播，同時(shí)mcr-1基因可與其他耐藥基因共存于同一細(xì)菌菌株中[8]，從而形成危害更大的多重耐藥甚至泛耐藥超級(jí)細(xì)菌。攜帶mcr-1基因大腸桿菌的出現(xiàn)，對(duì)于公共衛(wèi)生安全和人類健康而言是一個(gè)極大的威脅，而傳統(tǒng)的抗生素對(duì)多重耐藥細(xì)菌引起的疾病療效甚微，因此尋求新型的抗菌制劑已迫在眉睫。

噬菌體(Bacteriophage)能特異性感染宿主細(xì)菌，被稱為最重要的天然殺菌物質(zhì)[9-10]。相比于抗生素，噬菌體能高效殺滅特定細(xì)菌，且不影響正常菌群生長(zhǎng)，而且噬菌體能有效規(guī)避因使用抗生素而造成的細(xì)菌耐藥性問題。研究結(jié)果表明，寄生在大腸桿菌中的噬菌體能有效殺死耐藥菌株，可作為新型的殺菌制劑，市場(chǎng)應(yīng)用前景廣闊。本試驗(yàn)以來源于豬養(yǎng)殖場(chǎng)的mcr-1陽性大腸桿菌為宿主菌，分離對(duì)其具有殺滅作用的裂解性噬菌體，研究該噬菌體的生物學(xué)特性，以期為mcr-1陽性大腸桿菌的防控提供新思路和有效的技術(shù)手段。

1 材料和方法

1.1 主要試劑和儀器

LB培養(yǎng)基參照Sambrook等[10]配制，PEG8000和蛋白酶K購于美國Amresco公司，DNase I和RNaseA購于Sigma-Aldrich公司，Hind III購于日本TOYOBO公司。

1.2 菌株和污水

mcr-1陽性大腸桿菌SQ-P -E32分離自江蘇宿遷某豬養(yǎng)殖場(chǎng)的豬糞便樣本，污水取自該養(yǎng)殖場(chǎng)的糞水。mcr-1陽性大腸桿菌及mcr-1陰性大腸桿菌臨床株為本實(shí)驗(yàn)室分離保藏菌株，宿主來源為豬。

1.3 噬菌體的分離和純化

參照Sambrook等[11]的方法取豬場(chǎng)污水。將樣品在4 ℃溫度下以4 000g離心15 min后取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜除去雜質(zhì)和細(xì)菌。取10 ml上述濾液加入10 ml 2×LB、1 ml對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期mcr-1陽性大腸桿菌SQ-P-E32菌懸液和適量CaCl2液體，并最終將CaCl2濃度調(diào)為1 mmoL/ml。靜置15 min后轉(zhuǎn)至37 ℃搖床(160 r/min)振蕩培養(yǎng)12 h。將所得培養(yǎng)物于4 ℃溫度下以10 000g離心10 min后取上清液，經(jīng)0.22 μm濾膜后即得SQ-P-E32菌對(duì)應(yīng)的噬菌體原液。

采用雙層平板法[12]檢測(cè)和篩選裂解性噬菌體。取上述原液0.1 ml，適當(dāng)稀釋后加入宿主菌懸液0.1 ml。靜置數(shù)分鐘后加入3.5 ml 50 ℃左右的0.6% LB半固體培養(yǎng)基，混勻平鋪至LB固體培養(yǎng)基上。37 ℃培養(yǎng)6～8 h后觀察噬菌斑生長(zhǎng)情況。若有噬菌斑，挑取單個(gè)形態(tài)均勻、清晰無暈環(huán)的菌斑，溶于含有0.9 ml 緩沖液的無菌EP管中，加氯仿，放置1 h，4 ℃過夜。次日取0.1 ml上述溶液適當(dāng)稀釋，與宿主菌做雙層平板。如此重復(fù)7～8次，即可獲得純種噬菌體。

1.4 噬菌體的透射電鏡分析

參照文獻(xiàn)[11]的方法，將經(jīng)聚乙二醇沉淀法純化后的噬菌體滴在銅網(wǎng)上， 10 min后用濾紙從側(cè)面吸干銅網(wǎng)上的多余液體。加一滴2%磷鎢酸(PTA，pH=7.0)于銅網(wǎng)，染色10 min后將銅網(wǎng)放于干燥濾紙上，自然干燥后電鏡觀察。

1.5 噬菌體的基因組分析

參照文獻(xiàn)[11]的方法，向經(jīng)聚乙二醇沉淀法純化后的噬菌體懸液中加入DNase Ⅰ和RNase A至終濃度均為1 μg/ml，37 ℃溫育30 min。加蛋白酶K(終濃度為50 μg/ml)及SDS(終濃度為0.5%，質(zhì)量體積比)，混勻后56 ℃水浴過夜。次日，向消化液中加等體積的苯酚∶氯仿∶異戊醇(25∶24∶1)，反復(fù)抽提2次，收集親水相，再用氯仿抽提1次后，用無水乙醇沉淀核酸。所得核酸沉淀用70%乙醇洗滌后溶于超純水中待用。

將提取的核酸用DNase I、RNase A和Mung Bean Nuclease進(jìn)行處理，同時(shí)使用DNA限制性內(nèi)切酶EcoR I和Hind Ⅲ 酶切，對(duì)產(chǎn)物做瓊脂糖凝膠電泳分析。根據(jù)酶消化處理結(jié)果確定噬菌體基因組核酸類型，根據(jù)酶切結(jié)果初步估算其核酸大小。

1.6 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定

感染復(fù)數(shù)(Multiplicity of infection,MOI)為感染初期加入噬菌體的數(shù)量與宿主菌數(shù)量的比值。具體操作參照Lu等[13]的方法。首先選取分離出的宿主菌的單菌落，將其接種在新鮮的LB液體培養(yǎng)液中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。將細(xì)菌的濃度調(diào)整為1.0×108CFU/ml。按照MOI分別為0.01，0.10，1.00，10.00, 100.00和1 000.00將相應(yīng)數(shù)量的噬菌體液加入到已準(zhǔn)備好的宿主菌液中并充分混勻。之后將所得混合菌液置于37 ℃搖床160 r/min震蕩培養(yǎng)5 h。用雙層瓊脂平板法測(cè)定裂解液中噬菌體的效價(jià)，產(chǎn)生最高效價(jià)的感染復(fù)數(shù)即為最佳MOI。同樣條件下試驗(yàn)重復(fù)3次，每組2個(gè)重復(fù)。

1.7 噬菌體一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

一步生長(zhǎng)曲線(One step growth curve)的測(cè)定參照Weiss等[14]的方法，略有改動(dòng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌SQ-P-E32的懸液，調(diào)整濃度至1×108CFU/ml。向宿主菌菌液中以MOI=100加入噬菌體，37 ℃孵育15 min后12 000 r/min離心1 min，棄掉上清液，用新鮮的LB液體洗滌1次后再棄上清液。等體積加入37 ℃預(yù)熱的LB液體培養(yǎng)基，重懸沉淀后充分混勻，迅速置于37 ℃搖床160 r/min振蕩培養(yǎng)。同時(shí)開始計(jì)時(shí)，在0時(shí)刻取樣1次，以后每隔10 min取樣1次，共取9次。采用雙層瓊脂平板法測(cè)定噬菌體的效價(jià)(滴度)。以感染時(shí)間為橫坐標(biāo)，噬菌體效價(jià)為縱坐標(biāo)，繪制噬菌體的一步生長(zhǎng)曲線，估算出噬菌體的潛伏期、爆發(fā)期、爆發(fā)量。分別設(shè)置無噬菌體宿主菌培養(yǎng)液和無宿主菌噬菌體培養(yǎng)液作為對(duì)照。同樣條件下試驗(yàn)重復(fù)3次，每組2個(gè)重復(fù)。

1.8 噬菌體熱穩(wěn)定性測(cè)定

取效價(jià)為6×108PFU/ml的mcr-1噬菌體懸液分別于30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃的水浴鍋中分別作用30 min和60 min后，利用雙層瓊脂平板法測(cè)定處理后的噬菌體效價(jià)。同樣條件下試驗(yàn)重復(fù)3次，每組2個(gè)重復(fù)。

1.9 噬菌體pH穩(wěn)定性測(cè)定

取10份體積為100 μl效價(jià)為6×108PFU/ml噬菌體懸液分別放于pH值分別為2、3、4、5、6、8、9、10、11和12的胰蛋白胨水(900 μl)中，37 ℃作用2 h。利用雙層平板試驗(yàn)測(cè)定處理后的噬菌體，37 ℃培養(yǎng)過夜。同樣條件下試驗(yàn)重復(fù)3次，每組2個(gè)重復(fù)。

1.10 噬菌體裂菌效力測(cè)定

1.10.1 噬菌體體外裂解動(dòng)力學(xué) 將宿主菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600值為0.45，約2.0×108CFU/ml)分別按MOI為0，0.01，0.10，1.00，10.00，100.00加入噬菌體并于37 ℃搖床(160 r/min)中培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。以未加噬菌體的細(xì)菌培養(yǎng)液為對(duì)照，每30 min測(cè)定各組OD600值，測(cè)定總時(shí)長(zhǎng)為5 h。以此觀察噬菌體在不同時(shí)刻對(duì)細(xì)菌的裂解效力。

1.10.2 噬菌體裂解效力評(píng)定 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期宿主菌，分別按MOI為0，0.01，0.10，1.00，10.00，100.00加入噬菌體并于37 ℃搖床(160 r/min)中培養(yǎng)，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)。分別于0 h和5 h時(shí)利用平板涂布法測(cè)定各組樣品中宿主菌的濃度，以觀察噬菌體的殺菌效力。

1.11 噬菌體宿主譜分析

采用點(diǎn)樣法，測(cè)定噬菌體對(duì)大腸桿菌的裂解活性。將31株來自江蘇地區(qū)3個(gè)不同豬養(yǎng)殖場(chǎng)的大腸桿菌菌株過夜培養(yǎng)，其中包括26株mcr-1陽性菌株，5株mcr-1陰性菌株，分別取100 μl菌液加入到1.2%固體培養(yǎng)基中，涂布棒涂布均勻，待菌液干后，取10 μl噬菌體懸液滴加到不同的平板上，37 ℃培養(yǎng)過夜，觀察有無透亮斑出現(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 噬菌體的分離純化及透射電鏡觀察

本試驗(yàn)以mcr-1陽性大腸桿菌SQ-P-E32為宿主菌，經(jīng)過雙層平板法反復(fù)純化噬菌斑4～5次后便能得到純化的噬菌體，命名為vB-EcoP-32。其噬菌斑形態(tài)如圖1所示，噬菌體對(duì)宿主菌可形成圓形(直徑1～2 mm)、邊緣整齊無暈環(huán)的噬菌斑，屬于典型的裂解性噬菌體特征。

圖1 噬菌體vB-EcoP-32噬菌斑Fig.1 Plaques of bacteriophage vB-EcoP-32

2.2 噬菌體的透射電鏡形態(tài)

從透射電鏡圖(圖2)可見，噬菌體vB-EcoP-32頭部呈圓柱狀，長(zhǎng)約100 nm，直徑約40 nm；其尾部較短，長(zhǎng)約15 nm，直徑約10 nm。根據(jù)國際病毒分類學(xué)組織(International committee on taxonomy of viruses，ICTV)病毒分類第8次報(bào)告，可初步將vB-EcoP-32噬菌體歸類為短尾噬菌體科。

圖2 噬菌體vB-EcoP-32透射電鏡形態(tài) (Bar=100 nm)Fig.2 Transmission electron microscope of bacteriophage vB-EcoP-32 (Bar=100 nm)

2.3 噬菌體的基因組酶切分析

噬菌體vB-EcoP-32基因組僅能夠被DNase I消化，而不能夠被RNase A和Mung Bean Nuclease消化，說明該噬菌體基因組為雙鏈DNA。通過限制性核酸內(nèi)切酶EcoR I 和Hind Ⅲ對(duì)噬菌體基因組進(jìn)行酶切(圖3)，根據(jù)酶切條帶與DNA marker的關(guān)系，初步估算該噬菌體基因組的分子量約為50 kb，其確切的分子量大小還需要通過全基因組測(cè)序才能確定。

泳道M1和M2分別為15 kb 和 2 kb Marker，泳道1為噬菌體vB-EcoP-32基因組，泳道2和3分別為噬菌體vB-EcoP-32基因組被EcoR I 和 Hind Ⅲ消化后的產(chǎn)物。圖3 噬菌體vB-EcoP-32基因組限制性內(nèi)切酶酶切圖譜Fig.3 Electrophoresis of bacteriophage vB-EcoP-32 genome digested with EcoR I and Hind Ⅲ

2.4 噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)

3次重復(fù)試驗(yàn)取平均值，由表1可知，當(dāng)MOI=100.00時(shí)，噬菌體感染宿主后產(chǎn)生的子代噬菌體滴度為 1.2×1012PFU/ml，是所測(cè)的6個(gè)感染復(fù)數(shù)中最高的。因此，該噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)為100.00。

表1噬菌體最佳感染復(fù)數(shù)的測(cè)定

Table1Determinationofoptionalmultiplicityofinfection

感染復(fù)數(shù)(PFU/CFU)子代噬菌體滴度(PFU/ml)1000．009．0×1011100．001．2×101210．008．4×10111．005．2×10110．104．0×10110．012．1×1011

2.5 噬菌體一步生長(zhǎng)曲線的測(cè)定

由圖4可知，vB-EcoP-32噬菌體感染宿主菌的潛伏期約為5 min，爆發(fā)期約為55 min。在爆發(fā)期噬菌體的效價(jià)為 1.8×107，細(xì)菌的濃度為 5.5×105,噬菌體的裂解量約為32。

圖4 噬菌體一步生長(zhǎng)曲線Fig.4 One-step growth curve

2.6 噬菌體熱穩(wěn)性

由圖5可知，噬菌體vB-EcoP-32經(jīng)30 ℃、40 ℃、50 ℃處理30 min和60 min后其效價(jià)基本較穩(wěn)定，能保持原活性。在60 ℃溫度下分別作用30 min和60 min后，其效價(jià)有所下降，但均能保持在106PFU/ml以上。經(jīng)70 ℃處理后噬菌體的效價(jià)明顯下降。經(jīng)80 ℃處理30 min后，噬菌體完全失活，說明高溫會(huì)嚴(yán)重影響噬菌體的活性。綜上，噬菌體在 30～60 ℃活性較穩(wěn)定。

圖5 溫度耐受能力Fig.5 Tolerance to temperatures

2.7 噬菌體pH值穩(wěn)定性

由圖6可知，當(dāng)培養(yǎng)液pH值在5～10時(shí)，噬菌體效價(jià)較穩(wěn)定，基本上能保持原活性。當(dāng)培養(yǎng)液的pH值小于5或pH值大于10時(shí)，噬菌體的活力會(huì)隨著酸性或堿性的增強(qiáng)而逐漸降低。當(dāng)pH值小于3或者大于11時(shí)噬菌體完全失活。這說明過酸和過堿都會(huì)造成噬菌體活性降低，甚至使噬菌體完全失活。

圖6 酸堿的耐受能力Fig.6 Tolerance to acidity and alkalinity

2.8 噬菌體裂解效力

2.8.1 不同MOI值時(shí)細(xì)菌數(shù)量的動(dòng)態(tài)曲線 由圖7可知，當(dāng)MOI=0時(shí)，宿主菌培養(yǎng)液中不含噬菌體，該組樣品OD600隨著時(shí)間變化呈現(xiàn)明顯的指數(shù)型上升趨勢(shì)，最后趨于穩(wěn)定。表明該組細(xì)菌在無噬菌體存在的情況下呈指數(shù)型擴(kuò)增，最后受環(huán)境限制而趨于穩(wěn)定。而當(dāng)MOI為0.01、0.10、1.00、10.00、100.00時(shí)，各組OD600均呈先上升后下降最后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì)。感染初期噬菌體對(duì)細(xì)菌生長(zhǎng)影響較小，但隨著噬菌體的不斷復(fù)制,裂解細(xì)菌后，細(xì)菌的增殖逐漸受到抑制，最終各處理組細(xì)菌均逐漸趨于消亡。另外，當(dāng)MOI值越大時(shí)，OD600下降到最低所需的時(shí)間越短，說明噬菌體對(duì)細(xì)菌的殺菌效果越明顯。本試驗(yàn)中，MOI為100.00時(shí)，裂解效果最佳。

圖7 噬菌體裂解細(xì)菌的動(dòng)態(tài)曲線Fig.7 Lytic kinetics of bacteriophage vB-EcoP-32

2.8.2 不同MOI值時(shí)噬菌體的殺菌效果 由圖8可得，對(duì)照組中細(xì)菌以MOI為0、0.01、0.10、1.00、10.00、100.00加入噬菌體并培養(yǎng)5 h后，各組培養(yǎng)液中細(xì)菌的數(shù)量較0 h均有所下降。處理5 h后，MOI值為0.01處理組中的細(xì)菌數(shù)量較對(duì)0 h下降了約0.80lg，MOI值為0.10處理組中的細(xì)菌數(shù)量較對(duì)0 h下降了約1.88lg，MOI值為1.00處理組中的細(xì)菌數(shù)量較對(duì)0 h下降了約3.33lg，MOI值為10.00處理組中的細(xì)菌數(shù)量較對(duì)0 h下降了約4.05lg,MOI值為100.00處理組中細(xì)菌數(shù)量較0 h下降了約5.60lg。隨著MOI值的增加，5 h時(shí)的細(xì)菌數(shù)量較0 h下降幅度逐漸增大，表明高濃度的噬菌體殺菌效果要優(yōu)于低濃度噬菌體。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。圖8 不同MOI值時(shí)噬菌體殺菌效果評(píng)價(jià)Fig.8 Value of sterilization ability of bacteriophage in different MOI

2.8.3 噬菌體的裂解譜 通過點(diǎn)樣試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)噬菌體vB-EcoP-32能有效殺滅31株豬源大腸桿菌中的19株，殺菌率為61.3%，這19株豬源大腸桿菌有16株為mcr-1陽性大腸桿菌，其余3株為mcr-1陰性大腸桿菌，分別來源于豬場(chǎng)I(7株)、豬場(chǎng)II(5株)和豬場(chǎng)III(7株)3個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)，說明噬菌體vB-EcoP-32為寬宿主譜的大腸桿菌裂解性噬菌體，對(duì)豬源大腸桿菌(包括mcr-1陽性菌株)具有較好的殺滅作用。

3 討 論

3.1 噬菌體的分離與鑒定

噬菌體廣泛存在于自然界的土壤、廢水中，寄生于其對(duì)應(yīng)的宿主菌中。因?yàn)槭删w只能利用宿主菌中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)行生命活動(dòng)，離開宿主菌后就不能生長(zhǎng)和復(fù)制。在本研究中，分離純化初期的噬菌斑呈蠶噬狀、大小不一，表明此時(shí)培養(yǎng)基中還含有其他噬菌體[15]，但經(jīng)過數(shù)次純化后噬菌斑形態(tài)大小才變得較為一致。透射電鏡圖顯示該噬菌體尾長(zhǎng)僅為15 nm，較張培東等[16]報(bào)道的尾長(zhǎng)為100 nm的大腸桿菌噬菌體Bp6不同，其圓柱狀的頭部較代保英等[17]報(bào)道的多面體頭部的大腸桿菌噬菌體BpD也不同，說明不同地區(qū)分離的大腸桿菌噬菌體形態(tài)有所差異。通過透射電鏡圖顯示的噬菌體的外形特征，可初步判斷該噬菌體屬于短尾噬菌體科，并且其噬菌斑透亮、邊緣整齊，說明該噬菌體為裂解性噬菌體。根據(jù)該噬菌體基因組被DNase I、RNase A和Mung Bean Nuclease消化的情況，可判定該噬菌體為雙股DNA噬菌體。

3.2 噬菌體的生物學(xué)特性與裂解效力評(píng)價(jià)

不同的噬菌體，其生物學(xué)特性也不盡相同[18]，掌握特定噬菌體的生物學(xué)特性對(duì)于其相關(guān)的研究及應(yīng)用具有重要的指導(dǎo)意義。最佳感染復(fù)數(shù)對(duì)于經(jīng)濟(jì)高效地獲得噬菌體產(chǎn)量具有重要指導(dǎo)意義。本研究中，噬菌體vB-EcoP-32對(duì)于其宿主菌的最高感染復(fù)數(shù)為100，與杜崇濤[19]報(bào)道的大腸桿菌0157的噬菌體DLS48(最佳MOI=0.1)和王禮偉等[20]報(bào)道的大腸桿菌噬菌體EcP10(最佳MOI=1.0)的結(jié)果相差較大。這可能是因?yàn)楸狙芯恐惺删w屬于裂解性噬菌體中較為溫和的一類，其感染和復(fù)制的進(jìn)程都較慢。Abedon等[21]提出，每一個(gè)細(xì)菌對(duì)噬菌體敏感度不一樣，每個(gè)噬菌體感染細(xì)菌的能力也不一樣，因此在噬菌體療法試驗(yàn)中，不宜把MOI作為確定噬菌體最佳給藥劑量的唯一指標(biāo)。

動(dòng)物養(yǎng)殖上大量使用抗生素導(dǎo)致的耐藥細(xì)菌出現(xiàn)與流行對(duì)動(dòng)物的健康養(yǎng)殖造成巨大威脅，而攜帶多黏菌素耐藥基因mcr-1的大腸桿菌的出現(xiàn)更是對(duì)公共衛(wèi)生和人類健康提出了嚴(yán)峻挑戰(zhàn)。相比于抗生素，噬菌體能高效殺滅特定細(xì)菌，且不影響正常菌群生長(zhǎng)，而且噬菌體能有效規(guī)避因使用抗生素而造成的細(xì)菌耐藥性問題?；诖?，本研究分離了對(duì)mcr-1陽性大腸桿菌具有裂解性的噬菌體，通過研究其生物學(xué)特性，以期為mcr-1陽性大腸桿菌的防控提供新思路和有效的技術(shù)手段。本研究中噬菌體裂解細(xì)菌動(dòng)態(tài)圖顯示，在加入噬菌體后，各處理組細(xì)菌數(shù)量下降明顯，而對(duì)照組居高不下，噬菌體添加濃度越大，其滅菌效率越高。研究發(fā)現(xiàn)大腸桿菌K88對(duì)應(yīng)噬菌體K88-4[22]的MOI值為0.0 001時(shí)5 h內(nèi)細(xì)菌濃度下降4lg，MOI值為1時(shí)殺菌效果為100%。本研究中，當(dāng)MOI值為100時(shí)相同時(shí)間內(nèi)細(xì)菌濃度下降了約5lg，并且細(xì)菌數(shù)量逐漸趨于穩(wěn)定。本研究中噬菌體對(duì)來自3個(gè)養(yǎng)殖場(chǎng)的31株豬源大腸桿菌殺菌率高達(dá)61.3%。該噬菌體的殺菌效果如此顯著，其對(duì)于開發(fā)耐藥細(xì)菌的噬菌體療法的意義不言而喻。但有學(xué)者[23]發(fā)現(xiàn)，自然界還存在著耐噬菌體的菌株，這也意味者噬菌體療法并不能一勞永逸。人類與致病菌的斗爭(zhēng)還將繼續(xù)，噬菌體療法還有待于進(jìn)一步的研究與改進(jìn)。

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