牛副流感病毒3型RT-PCR方法的建立及初步應(yīng)用

王 吉, 付 瑞, 李曉波, 王淑菁, 王莎莎, 李 威, 秦 驍, 鞏 薇, 岳秉飛, 賀爭鳴

(中國食品藥品檢定研究院 國家實驗動物微生物遺傳檢測中心, 北京 100050)

牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type3, BPIV3) 屬副黏病毒科(paramyxoviridae)副黏病毒亞科(paramyxovirinae)呼吸道病毒屬(respirovirus)成員，為單鏈負股有囊膜的RNA病毒[1]。1959年Reisinger等[2]和Hoerlein等[3]在美國的牛體中首次分離到BPIV3，同時在這些動物中查出了該病毒的抗體[2-4]。目前，BPIV3廣泛流行于世界各國，在美洲、歐洲、亞洲各國均不斷發(fā)生或流行[4]。血清學(xué)調(diào)查結(jié)果顯示BPIV3在我國流行比較廣泛[4]。以支氣管炎、肺炎等呼吸道癥狀為主要特征[4,5]。嚴重威脅養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展。同時BPIV3也是一種重要的人獸共患病毒[1]，不僅對飼養(yǎng)人員造成威脅，而且通過潛在污染人用牛源性產(chǎn)品對人民用藥安全造成潛在威脅。

隨著生物醫(yī)藥生產(chǎn)技術(shù)的迅猛發(fā)展，動物源性生物制品的開發(fā)利用日益增多，尤其是牛源產(chǎn)品及副產(chǎn)品的生產(chǎn)應(yīng)用越來越廣泛，同時伴隨著科技及對藥品生物制品質(zhì)量發(fā)展的要求，人們對牛源性制品是否攜帶或潛在病毒污染，尤其是可直接對人民用藥安全造成威脅的人獸共患病毒越來越關(guān)注。為保障人民用藥安全及避免傳染病的擴散，最大限度地降低使用牛源性產(chǎn)品傳播牛攜帶BPIV3的風(fēng)險,本實驗建立了快速、特異、敏感的BPIV3 RT- PCR方法，用于對牛及人用牛源性制品及原材料可能攜帶或潛在BPIV3 的檢測，對保證牛源材料及牛源產(chǎn)品的使用安全性、保障人民用藥安全非常重要。

1 材料與方法

1.1 病毒及樣品

BPIV3、傳染性牛鼻氣管炎病毒(bovine herpesvirus type 1, BHV-1)、牛病毒性腹瀉病毒(bovine viral diarrhea virus，BVDV)、購自美國標準生物品收藏中心 (ATCC)(編號分別為VR-281、VR-188、VR-1422); 仙臺病毒(Sendai virus，SV)由本室保存;12批次小牛血清去蛋白注射液和脾多肽注射液(編號NY1～NY12)由國內(nèi)3個廠家提供，64份牛血漿樣本(編號分別為X1～X61)由北京某單位提供，61份牛鼻拭子樣本(編號分別為b1～b61)由內(nèi)蒙古自治區(qū)某單位提供。

1.2 主要試劑

DNA/RNA快速提取試劑盒購自德國Qiagen公司; 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Promega公司; Taq DNA聚合酶和100 bp DNA marker均購自日本TaKaRa公司; PCR儀和核酸瓊脂糖凝膠電泳儀均購自美國Bio-RAD公司(PwerPac Basic); 凝膠成像分析儀購自美國Kodak公司(GL212Pro)。

1. 3 引物設(shè)計及合成

分析已報道的BPIV3序列，選擇神經(jīng)氨酸酶(HN)基因保守區(qū)域作為靶基因。根據(jù)GenBank中登陸的BPIV3HN基因(序列號: AF178655.1)，用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計2組引物(表1)。引物由上海生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表 1 用于擴增HN2基因的引物序列及位置Table 1 Used for amplification HN2 gene primer sequence and position

1.4 病毒DNA提取

對正常牛腎細胞(bovine kidney cells，MDBK細胞)、BPIV3感染MDBK細胞毒、BVDV、BHV-1、SV，按照DNA/RNA快速提取試劑盒操作方法進行DNA/RNA提取。提取的DNA樣本凍存于-70 ℃冰箱備用。提取的RNA樣本立即進行cDNA合成。

1.5 PCR檢測方法的建立及引物的篩選

以獲得的cDNA為模板進行PCR擴增。對2組引物PCR反應(yīng)體系的dNTPs濃度、10×Buffer濃度、Taq HS酶濃度、引物、模板量、及反應(yīng)體系的退火溫度及循環(huán)次數(shù)等進行優(yōu)化，通過對正常MDBK細胞、BPIV3感染MDBK細胞毒的進行PCR擴增來確定PCR反應(yīng)的最佳模式及最佳引物。

1.6 PCR產(chǎn)物的檢測

取5 μL擴增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分數(shù)1.0%瓊脂糖凝膠進行電泳鑒定。電泳緩沖液為1×TAE(0.04 mol/L Tris乙酸，0.001 mol/L EDTA，pH8.0)，110 V電泳30 min，在紫外成像儀下觀察PCR產(chǎn)物條帶在凝膠中的位置，以100 bp DNA ladder Marker為參照物，判定結(jié)果。PCR陽性擴增片段進行測序，通過與Genbank 中BPIV3序列進行比對以確定PCR檢測的準確性[7]。

1.7 特異性的試驗

在方法建立及最佳引物篩選的基礎(chǔ)上，分別以BPIV3感染MDBK細胞毒、BVDV、BHV-1、 SV及正常MDBK細胞的DNA/cDNA為模板，用篩選出的最佳引物2(HN2)建立的PCR方法進行擴增，擴增產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠電泳做初步鑒定。

1.8 敏感性的試驗

取感染滴度為6.5 lgTCID50/mL BPIV3病毒液，用PBS做10倍梯度稀釋，分設(shè)原液到10-6共7個稀釋度。取每個稀釋度病毒液各0.2 mL制備模板，用引物2分別進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)質(zhì)量分數(shù)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，確定所能檢測病毒最小滴度[7]。

1.9 穩(wěn)定性和重復(fù)性實驗

取10-3～10-5BPIV3 cDNA及同一批PCR檢測試劑在-30 ℃冰箱放置12個月時，用引物2進行PCR檢測，每個稀釋梯度cDNA各做3個重復(fù)。擴增產(chǎn)物經(jīng)1.5 %瓊脂糖凝膠電泳鑒定[7]。

1.10 應(yīng)用

取12份牛源性制品樣本(12份小牛血清去蛋白注射液和脾多肽注射液樣本編號: NY1～NY12)、64份牛血漿樣本(編號: X1～X64)、61份牛鼻拭子樣本(編號: b1～b61)、及正常MDBK細胞與BPIV3同時提取RNA, 逆轉(zhuǎn)錄cDNA 用引物2進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳做初步鑒定。

擴增到的陽性樣品進行測序鑒定。測序結(jié)果經(jīng)BLAST分析，與GenBank中BPIV3核酸序列進行比對，驗證檢測結(jié)果的準確性。

2 結(jié)果

2.1 PCR檢測方法的建立

2.1.1 最佳反應(yīng)條件的確定 通過對2組引物PCR反應(yīng)條件及反應(yīng)體系的優(yōu)化，確定了PCR最佳反應(yīng)體系為: 10 × ExTaq Buffer(含 Mg2+) 2 μL, dNTPs Mixture(10 mmol/L) 2 μL, Taq HS酶(5 U/μL) 0.5 μL,上下游引物(10 pmol/μL)各 1 μL, DNA 2 μL，補水至20 μL; PCR最佳反應(yīng)條件為: 94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性 30 s，55 ℃退火 30 s, 72 ℃延伸 1 min, 共35個循環(huán); 72 ℃再延伸5 min。

2.1.2 最佳引物的確定 2組引物以BPIV3為模板進行擴增，HN1和HN2引物均有明顯目的條帶出現(xiàn)，但HN2較HN1擴增效果更好(圖1)，因此選擇HN2引物建立RT-PCR檢測方法。

2.2 方法的特異性實驗

HN2引物特異性實驗顯示以BPIV3 cDNA為模版有明顯的目的條帶出現(xiàn)，以BVDV、BHV-1、SV及正常MDBK細胞的DNA/cDNA為模板，均無目的條帶出現(xiàn)(圖2)。

2.3 方法檢測結(jié)果的準確性

選擇引物2 PCR擴增BPIV3陽性片段進行測序,測序結(jié)果經(jīng)BLAST分析, 與GenBank中BPIV3核酸序列同源性為99%, 說明該方法檢測準確性較好(圖3)。

圖 1 引物篩選結(jié)果Figure 1 The results of primers screening

圖 2 引物2 特異性條件驗證Figure 2 Specific validation results of primer 2

圖 3 引物2 PCR擴增BPIV3陽性片斷與GenBank中BPIV3毒株序列比對結(jié)果Figure 3 The comparison results of primer 2 PCR BPIV3 positive amplification fragment with BPIV3 in GenBank

2.4 方法敏感性試驗

通過圖4敏感性結(jié)果顯示，引物2檢測病毒滴度均可以達到6 lgTCID50/mL。

2.5 方法穩(wěn)定性和重復(fù)性實驗

電泳結(jié)果顯示, 10-3～10-5BPIV3 cDNA 在-30 ℃冰箱放置12個月時，用引物2進行檢測，仍能擴增出約610 bp明顯可見目的條帶(圖5)。

圖 4 引物2 PCR檢測敏感性測定-BPIV3細胞毒濃度梯度Figure 4 The sceptibility testing results of RT-PCR using primers 2-cytotoxic concentration gradient of BPIV3

圖 5 引物2 PCR穩(wěn)定性測定Figure 5 The repeatability and stability testing results of PCR using primers 2

2.6 初步應(yīng)用

2.6.1 牛血漿檢測 利用引物2建立的PCR檢測方法, 對64 份牛血漿樣本(編號: X1～X64)進行檢測。電泳結(jié)果顯示有11份樣本(編號為: X4、X6、X8、X13、X19、X20、X29、X35、X40、X42、X62)擴增到約610 bp的可見目的條帶, 其他53份牛血漿樣本均未擴增到可見目的條帶(圖6～圖8)。

圖 6 PCR方法檢測21份牛血漿樣本(X1～X21)電泳結(jié)果Figure 6 The results of Primers 2 PCR to detect 21 bovine plasma samples (X1～X21)

圖 7 PCR方法檢測22份牛血漿樣本 (X22～X43) 電泳結(jié)果Figure 7 The results of Primers 2 PCR to detect 22 bovine plasma samples (X22～X43)

2.6.2 牛鼻拭子檢測 利用引物2建立的PCR檢測方法, 對61 份牛鼻拭子樣本(編號分別為b1～b61)進行檢測。電泳結(jié)果顯示, 有9份牛鼻拭子樣本(編號為: b7、b10、b16、b44、b51、b53、58、b59、b60)擴增到約610 bp的可見目的條帶; 其他52份牛牛鼻拭子樣本均未擴增到可見目的條帶(圖9、圖10)。b22～b40檢測結(jié)果均為陰性(電泳結(jié)果圖略)。

2.6.3 牛源性制品檢測 利用引物2建立的PCR檢測方法，對12份牛源成品樣本(樣本編號: NY1～NY12)檢測，結(jié)果均為陰性(電泳結(jié)果圖略)。

2.6.4 檢測結(jié)果的驗證 將BPIV3核酸檢測陽性的樣本 X4、X6、X8、X13、X19、X20、X29、X35、X40、X42、X62和b7、b10、b16、b44、b51、b53、58、b59、b60擴增產(chǎn)物測序，與GenBank中BPIV3標準株核苷酸序列進行比對，其同源性均在95% 以上。檢測137份樣本BPIV3核酸陽性率為14.6%。

3 討論

圖 8 PCR方法檢測21份牛血漿樣本 (X44～X64) 電泳結(jié)果Figure 8 The results of Primers 2 PCR to detect 22 bovine plasma samples (X22～X43)

圖 9 PCR方法檢測21份牛鼻拭子樣本(b1～b21)電泳結(jié)果Figure 9 The results of primers 2 PCR to detect 21 bovine nasal secretions samples (b1～b21)

圖 10 PCR方法檢測21份牛鼻拭子樣本 (b41～b61) 電泳結(jié)果Figure 10 The results of primers 2 PCR to detect 21 bovine nasal secretions samples (b41～b61)

BPIV3作為一種接觸性人獸共患病毒[5,7], 是構(gòu)成牛呼吸道綜合征(bovine respiratory disease complex,BRDc)的主要病毒[8]。不僅感染人和牛，同時還可感染豬、駱駝等動物[9,10]。雖然目前國內(nèi)外已有BPIV3 PCR檢測方法建立的報道[11-13]，但均沒有推廣應(yīng)用, 尤其是針對牛源產(chǎn)品及原輔材料外源BPIV3的檢測還未有報道。中華人民共和國藥典亦沒有關(guān)于牛源制品及原輔材料檢測的規(guī)定[14]。藥典在“新生小牛血清檢測”中雖然有關(guān)于新生牛血清用細胞接種法和免疫熒光法檢測病毒的規(guī)定[14], 但沒有更為敏感特異的分子生物學(xué)檢測方法，針對人用牛源性材料及人用牛源性生物制品的檢測還是空白。

本研究檢測了國內(nèi)5個廠家牛源性樣本(包括小牛血清去蛋白提取液、脾多肽注射液、牛血漿、牛鼻拭子等)137批次。其中檢測國內(nèi)3個廠家小牛血清去蛋白注射液12批次，結(jié)果均為陰性;檢測北京某單位64份牛血漿樣本陽性率為17.2%(11/64); 檢測內(nèi)蒙古自治區(qū)某單位61份牛血漿樣本陽性率為14.8%(9/61); 感染率與文獻報道相符[15,16]。137批次樣本BPIV3核酸檢出率為14.6%。實驗通過對可見的特異性目的條帶進行純化測序，證明20個有可見目的條帶的樣本為BPIV3。這也充分顯示了普通PCR在結(jié)果確認上可以通過測序驗證的優(yōu)點。從檢測結(jié)果看，牛源材料樣本中確實攜帶BPIV3，對人用牛源性制品構(gòu)成潛在的危險。

為了保障用藥的安全, 最大限度地降低使用牛源性生物制品傳播牛攜帶相關(guān)病毒的風(fēng)險，本實驗室建立了特異、敏感、操作簡單的RT-PCR方法,用于牛、人用牛源性生物制品以及用于生產(chǎn)牛源制品的原材料，如牛血漿、牛組織、牛源細胞等攜帶或潛在污染BPIV3的檢測, 不僅完善了BPIV3的檢測技術(shù), 為研發(fā)BPIV3 RT-PCR檢測試劑盒奠定了基礎(chǔ), 也為今后制定相關(guān)技術(shù)的國家標準及藥典的完善、在全國范圍內(nèi)推動牛源制品生產(chǎn)企業(yè)開展牛源制品及原輔材料BVDV檢測提供了技術(shù)支撐。

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