UPLC法測(cè)定維藥羅補(bǔ)甫克比日丸的西紅花藥材和制劑中西紅花苷的含量△

龐克堅(jiān) 翟 欣 唐 輝* 羅 蘭 王亞喬

(1.和田維吾爾藥業(yè)股份有限公司，新疆 和田 848200； 2.石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆特種植物藥資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 石河子 832002)

西紅花苷是名貴中藥西紅花的有效成分，具有抗血小板聚集，保護(hù)血管內(nèi)皮細(xì)胞，改善心肌缺血，調(diào)血脂等多種作用[1-7]，其中2個(gè)主要成分西紅花苷Ⅰ、西紅花苷Ⅱ亦是目前西紅花質(zhì)量控制的指標(biāo)成分。

羅補(bǔ)甫克比日丸是新疆維吾爾族特色藥之一，主要由丁香、西紅花、花椒、胡蘿卜子、肉桂、韭菜子等30 味藥材組成，具有溫補(bǔ)腦腎、益心填精的功效，主要用于陽(yáng)痿、抑郁、早泄、滑精、體虛、消瘦、神經(jīng)衰弱的治療，屬部頒標(biāo)準(zhǔn)維吾爾藥分冊(cè)收錄品種[8]。部頒標(biāo)準(zhǔn)僅采用理化鑒別試驗(yàn)來(lái)控制該制劑的質(zhì)量，并未對(duì)貴細(xì)藥材西紅花進(jìn)行質(zhì)量控制。制劑中西紅花的質(zhì)量與藥品療效密切相關(guān)，應(yīng)予以關(guān)注。為進(jìn)一步完善羅補(bǔ)甫克比日丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)對(duì)羅補(bǔ)甫克比日丸的西紅花藥材和制劑中的西紅花苷含量進(jìn)行測(cè)定，對(duì)全面客觀地評(píng)價(jià)羅補(bǔ)甫克比日丸藥品質(zhì)量提供科學(xué)依據(jù)。

1 儀器和試藥

1.1 儀器 Waters Acquity超高效液相色譜儀(包括四元高壓梯度泵、真空脫氣機(jī)、自動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、PDA檢測(cè)器、Empower 色譜工作站)，KH-300DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；十萬(wàn)分之一電子天平(BT125D，德國(guó)賽多利斯公司)。

1.2 試藥 西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ(批號(hào)：111588-201303、111589-201304中國(guó)食品藥品檢定研究院)，西紅花藥材(201611)、羅補(bǔ)甫克比日丸(批號(hào)：20170204、20170301、20170302) 由和田維吾爾藥業(yè)有限責(zé)任公司生產(chǎn)；乙腈為色譜純；水為雙蒸餾水；其它試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ色譜條件 采用 Waters HSS-C18 (100mm×2.1mm，1.8μm) 色譜柱，流動(dòng)相:以乙腈(A)-水溶液(B) 為流動(dòng)相，梯度洗脫(0～5 min，20% →40% A；5～5.5min，40%→20%A，5.5～6min，20% →20% A)，流速0.2 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)：440nm，柱溫為35 ℃，對(duì)照品進(jìn)樣體積1μL，西紅花藥材及供試品進(jìn)樣體積5μL。

2.2 溶液的配制

2.2.1 對(duì)照品溶液制備 精密稱(chēng)取西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌愤m量，分別加50%乙醇溶解，制成濃度分別為 0.543 mg/mL、0.603 mg/mL的對(duì)照品溶液。各取對(duì)照品溶液適量，加50%乙醇定容至5 mL容量瓶，制得西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ混合對(duì)照品濃度分別為54.30 μg/mL、60.30 μg/mL的混合對(duì)照品溶液。避光保存在4℃下備用。

2.2.2 西紅花藥材溶液的配制 取西紅花藥材約0.5 g，精密稱(chēng)定，加50%乙醇于25 mL容量瓶中，超聲(功率500 W，頻率50 kHz)30 min，放至室溫，用50%乙醇補(bǔ)足至刻度，過(guò)濾，濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.2.3 供試品溶液的配制 取羅補(bǔ)甫克比日丸1.5 g，精密稱(chēng)定，加50%乙醇于25 mL容量瓶中，超聲(功率500 W，頻率50 kHz)30 min，放至室溫，用50%乙醇補(bǔ)足至刻度，過(guò)濾，濾液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，即得。

2.3 系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 精密量取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液、西紅花藥材溶液和供試品溶液各適量，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄色譜，詳見(jiàn)圖1。由圖1可知，在該色譜條件下，各成分均能達(dá)到基線(xiàn)分離，分離度>1.5；理論板數(shù)以西紅花苷-Ⅰ峰計(jì)不少于5000，西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ保留時(shí)間分別為 4.683、5.463 min 。結(jié)果表明，其他成分對(duì)測(cè)定無(wú)干擾。

2.4 西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ線(xiàn)性關(guān)系考察 取“2.2.1”項(xiàng)下的混合對(duì)照品在“2.1”項(xiàng)色譜條件下分別取0.3、0.6、1.2、2.4、4.8和7.5 μL進(jìn)樣測(cè)定。以峰面積 Y 為縱坐標(biāo)，進(jìn)樣量X (μg)為橫坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 線(xiàn)性關(guān)系考察結(jié)果 (n=6)

2.5 西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ精密度試驗(yàn) 取同一混合對(duì)照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜峰面積，結(jié)果西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ峰面積的RSD分別為0.61%、0.54%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.6 西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ重復(fù)性試驗(yàn) 取同一樣品羅補(bǔ)甫克比日丸供試品溶液6份，每份1.5 g，精密稱(chēng)定，按“2.2.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行分析，記錄各色譜峰面積，結(jié)果西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ峰面積的RSD分別為1.6% 和0.99%，結(jié)果表明方法重復(fù)性良好。

2.7 西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ穩(wěn)定性試驗(yàn) 將制備的羅補(bǔ)甫克比日丸供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12 h內(nèi)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，結(jié)果西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ12 h內(nèi)的峰面積的RSD分別為1.5和1.3%。

2.8 西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已測(cè)知西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ2種成分準(zhǔn)確含量的羅補(bǔ)甫克比日丸9份，每份約0.5 g，精密稱(chēng)定，再分別精密加入相當(dāng)于含量80%、100%、120%的西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ?qū)φ掌啡芤?，按?.2.3”項(xiàng)方法分別制備得到低、中、高不同濃度的供試溶液，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算加樣回收率和RSD值，西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ平均加樣回收率( n=9) 分別為99.90%和100.1%，RSD 分別為1.6%和1.3%。結(jié)果表明該方法的加樣回收率良好。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)

3 含量測(cè)定

3.1 西紅花藥材含量測(cè)定 取西紅花藥材平行3份，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算羅補(bǔ)甫克比日丸中西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ的含量，結(jié)果見(jiàn)表3。

由結(jié)果表明，西紅花中西紅花苷的總量符合標(biāo)準(zhǔn)要求[9](>10%)。

表3 西紅花藥材含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果(mg/g n=3)

3.2 羅補(bǔ)甫克比日丸制劑含量測(cè)定 取3批樣品，分別按“2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算羅補(bǔ)甫克比日丸中西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

由結(jié)果表明，3份樣品西紅花苷含量相對(duì)較穩(wěn)定。

表4 樣品含量測(cè)定實(shí)驗(yàn)結(jié)果(μg/丸 n=3)

4 討論

4.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 取西紅花苷對(duì)照品儲(chǔ)備液(0.543 mg/mL、0.603 mg/mL)適量，用50%乙醇溶解并稀釋成18.10 μg/mL、20.10 μg/mL溶液，用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)于 200～600nm 處進(jìn)行掃描，從其紫外圖譜中可見(jiàn)其在440nm 處有最大吸收，與有關(guān)參考文獻(xiàn)[10]報(bào)道的440 nm 一致，故選擇440 nm 為檢測(cè)波長(zhǎng)。

4.2 提取溶劑的選擇 分別比較甲醇、50% 甲醇、乙醇、50%乙醇的提取效率，結(jié)果顯示50%乙醇提取效率最高，因此最終選擇50%乙醇作為提取溶劑。

4.3 流動(dòng)相的選擇 在選擇流動(dòng)相時(shí)，我們首先參照2015版中國(guó)藥典的色譜條件，甲醇-水(45:55)為流動(dòng)相，但此條件下西紅花苷-Ⅰ、西紅花苷-Ⅱ出峰峰形不理想，分離度較差。在綜合了有關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[10-14]的基礎(chǔ)上，經(jīng)過(guò)多次摸索，最終擬定了乙腈和水為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，所得峰形良好，分離度高。

5 結(jié)論

通過(guò)測(cè)定西紅花藥材中西紅花苷的含量，表明，企業(yè)在制劑生產(chǎn)中的藥材質(zhì)量是有保證的。測(cè)定的羅補(bǔ)甫克比日丸中西紅花苷的含量也符合企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)。

本實(shí)驗(yàn)所建立的超高效液相色譜分析方法與條件能較好地測(cè)定西紅花和羅補(bǔ)甫克比日丸中西紅花苷的含量。本實(shí)驗(yàn)方法精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性良好，結(jié)果穩(wěn)定可靠，并且采用的超高效液相色譜法相較高效液相色譜方法靈敏度高、分析時(shí)間短。能夠?yàn)榻⒏涌茖W(xué)規(guī)范的羅補(bǔ)甫克比日丸質(zhì)量評(píng)價(jià)和控制方法提供參考。

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