sEphB4對糖尿病視網(wǎng)膜病變兔模型視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞EphB4/EphrinB2和VEGF表達(dá)的影響

顏 堅 彭細(xì)峰 蔡玉蓮 鄧江濤 張 濤

深圳市龍崗中心醫(yī)院，廣東深圳 518116

糖尿病視網(wǎng)膜病變（diabetic retinopathy，DR）是糖尿病的常見并發(fā)癥之一，傳統(tǒng)的治療DR的方法有全視網(wǎng)膜光凝、玻璃體腔內(nèi)曲安奈德注射、玻璃體切割術(shù)等[1]，雖然上述治療方法在一定程度上能夠改善和挽救患者的中心視力，但易產(chǎn)生玻璃體腔內(nèi)積血、增殖膜形成、視網(wǎng)膜脫離等并發(fā)癥[2]，為了抑制或降低上述并發(fā)癥的發(fā)生，人們一直在不斷尋求和研發(fā)新的治療DR的方法。EphrinB2和Ephb4為在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（retinal pigment epithelial，RPE）和增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變內(nèi)膜（proliferative vitreoretinopathy，PVR）高表達(dá)的蛋白。有實驗研究證實，視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞EphrinB2呈高表達(dá)，一個細(xì)胞外域的EphB4受體的可溶性單體形式（sEphB4）可競爭性抑制受體激活，從而從總體上阻斷內(nèi)皮細(xì)胞功能和視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜新生血管的生成[3-5]。且sEphB4可抑制血小板衍生生長因子介導(dǎo)RPE細(xì)胞內(nèi)的EphB4和EphrinB2磷酸化，從而抑制RPE細(xì)胞的遷移、粘附和增殖[6]。

新生血管形成是一個復(fù)雜的病理過程，研究證實，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growthfactor，VEGF）是促進(jìn)新生血管形成的主要細(xì)胞因子，視網(wǎng)膜多種細(xì)胞均能合成與分泌VEGF，并受多種因素的影響。VEGF 是一種很強(qiáng)的內(nèi) 皮細(xì)胞有絲分裂原，可增加血管的通透性，刺激血管內(nèi)皮 細(xì)胞的增殖[7-8]。本研究擬采用DR兔眼模型進(jìn)行研究，利用DR兔眼模型和經(jīng)典類似于DR晚期增殖性視網(wǎng)膜病變的PVR兔眼模型，向玻璃體腔內(nèi)多次注射不同劑量的sEphB4。注射6個月后對兔眼視網(wǎng)膜及玻璃體增殖膜的血管內(nèi)皮細(xì)胞EphB4/EphrinB2和VEGF表達(dá)的影響進(jìn)行觀察分析。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

（1）試劑sEphB4（美國 VasGene Therapeutics公司），MTT、Anti-EPHB4 （美國Sigma公司），兔抗人EphB2抗體（美國Santa Cruz公司），（美國Sigma公司），DAB顯色劑（武漢博士德），Dylight488-SABC（武漢博士德），表皮細(xì)胞生長因子（EGF，美國Peprotech公司），全血基因組純化試劑盒（美國Axygen公司），SYBR Premix Ex Taq試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、REAL-TIMEPCR試劑盒（日本Takara），HEPES、Protein Kinase G（德國Merck公司），VEGF多克隆抗體（稀釋度1∶40，福州邁新公司）。（2）儀器設(shè)備、系統(tǒng)顯微鏡及圖像分析系統(tǒng)、Bio-TEK ELx800流式細(xì)胞儀、GeneAmp 9700型全自動PCR擴(kuò)增儀、5417C型高速臺式離心機(jī)、真空離心系統(tǒng)、7500 FAST定時定量PCR檢測儀、Class Ⅱ B2型無菌超凈工作臺、Universal HoodⅡ型凝膠數(shù)字成像系統(tǒng)、PowerPac 300型凝膠電泳系統(tǒng)、1255型恒溫水浴箱。

1.2 方法

1.2.1 糖尿病兔及DR模型建立 選8～10周的雄兔8只，麻醉后予5%四氧嘧啶150mg/kg耳緣靜脈注射。最初2h內(nèi)血糖會升高，然后過渡到低血糖期，24～48h后進(jìn)入持續(xù)性高血糖期。麻醉恢復(fù)后立即予高糖高脂飲食，并于飲食后4、8和12h皮下注射5%葡萄糖10mL。距試驗開始1個月時，若血糖持續(xù)＞300mg/dL且血液及尿液中出現(xiàn)糖基蛋白、尿素氮、尿糖、尿蛋白升高及電解質(zhì)紊亂，則表明糖尿病兔模型建立。糖尿病兔模型發(fā)展到12個月時雙眼FFA檢測出現(xiàn)熒光滲漏則為兔眼DR模型成功建立[9]。

1.2.2 sEphB4注射 將所有DR兔的右眼作為藥物干預(yù)組，分別予sEphB4（美國VasGene Therapeutics公司提供）的劑量依次為1000、500、200μg。左眼作為對照組，予以生理鹽水50μL玻璃體腔注入。 每月注射1次，治療6個月。

1.2.3 視網(wǎng)膜、玻璃體增殖膜樣本收集 實驗結(jié)束時，麻醉狀態(tài)下予巴比妥酸鹽100mg/kg靜脈內(nèi)注射致死后，進(jìn)行眼球摘除并實行全視網(wǎng)膜完整取樣、玻璃體增殖膜、視網(wǎng)膜取樣。

1.2.4 免疫組化Western blot檢測及VEGF檢測 利用各種特異性的抗體對切片進(jìn)行免疫組化染色，用EphB4，EphrinB2抗體檢測切片中各自的表達(dá)量，用血管內(nèi)皮細(xì)胞特異性抗體CD31檢查組織中血管密度和形態(tài)，各組干預(yù)后，提取每組的蛋白，經(jīng)過SDS-PACG電泳分離濃縮后得到目標(biāo)蛋白，并轉(zhuǎn)至PVDF膜上。后加入一抗（兔抗人EphrinB2多克隆抗體1：1000；兔抗人多克隆抗體1：1000），4度搖床過夜，漂洗后，加入稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗（1：1000）；溫室孵育2h，在漂洗，再用凝膠成像系統(tǒng)成像，分析蛋白條帶灰度值[10]。VEGF檢測：采用ELISA法，應(yīng)用上海博麥德生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的人VEGF ELISA試劑盒，取不同組實驗兔視網(wǎng)膜提取物與HRP標(biāo)記的抗體結(jié)合，形成抗體－抗原－酶標(biāo)抗體復(fù)合物，用酶標(biāo)儀在450nm波長下測定吸光度（A）值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中VEGF表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 兩組EphB4/EphrinB2蛋白表達(dá)比較

兩組EphB4/EphrinB2蛋白表達(dá)比較，隨著sEphB4濃度的不斷增加，EphB4、EphrinB2的表達(dá)降低。見圖1～2、表1。

2.2 各組治療后EphB4、EphrinB2、VEGF比較

隨著sEphB4濃度的不斷增加，EphB4、EphrinB2、VEGF水平逐漸降低，且均明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組治療后EphB4、EphrinB2、VEGF比較（ ± s）

表1 各組治療后EphB4、EphrinB2、VEGF比較（ ± s）

注：與對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與sEphB4 200μg組比較，#P＜0.05，##P＜0.01

組別 EphB4 EphrinB2 VEGF平（n/L）對照組 0.782±0.023 0.716±0.143 103.58±11.84 sEphB4 200μg 0.563±0.035*# 0.538±0.063# 80.35±6.63**##500μg 0.495土0.154* 0.412土0.346** 71.45±11.28**1000μg 0.153±0.062* 0.375土0.138* 61.13±7.24**F 3.238 2.871 8.342 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.01

3 討論

圖1 兩組EphB4/EphrinB2蛋白表達(dá)比較

圖2 應(yīng)用sEphB4后EphB4/EphrinB2蛋白表達(dá)

糖尿病是一種嚴(yán)重危害人民健康的慢性疾病。2000年，全世界約有1.5億患者，預(yù)計到2025年患病人數(shù)將達(dá)3億。近50年來，由于胰島素的問世，糖尿病的治療死亡率逐漸降低，而失明率逐漸增高。糖尿病病程超過20年的患者幾乎100%會出現(xiàn)糖尿病性視網(wǎng)膜病變[12-14]。DR是最主要的致盲眼病之一，成為全球眼科界關(guān)注的焦點，其有效治療是眼科基礎(chǔ)研究和臨床亟待解決的課題。增殖性糖尿病視網(wǎng)膜病變是臨床常見的新生血管性眼病，可導(dǎo)致嚴(yán)重的視功能損害，甚至失明[15-16]。由于視網(wǎng)膜毛細(xì)血管閉塞缺血、缺氧而形成的新生血管是增殖期糖尿病視網(wǎng)膜病變的主要病理特征，因此如何有效抑制視網(wǎng)膜新生血管形成是挽救PDR患者視力的關(guān)鍵。因此，開展對DR發(fā)病機(jī)制方面的研究，對防盲治盲、提高糖尿病患者的生存質(zhì)量具有重要意義。

目前國際上已有許多研究證實，Eph/Ephrin作為RTKs亞族中最大的一支，其家族中的EphB4/EphrinB2信號通道在組織損傷中的生理性血管形成和病理性傷口愈合中，對于細(xì)胞的遷移、粘附和增生起著指引和定位的作用。在早產(chǎn)兒增殖性視網(wǎng)膜病變和激光誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜脈絡(luò)膜新生血管等類似于PDR病理改變的動物模型中均檢測到EphB4/EphrinB2信號通道的激活及sEphB4在體外和活體中抑制脈絡(luò)膜新生血管作用明顯[17]。Eph/Ephrin調(diào)控著不同系列的細(xì)胞功能，象細(xì)胞遷移、增殖和粘附，他們對于脈管系統(tǒng)的發(fā)展也有著重要的影響。EphrinB2特異性地表達(dá)在動脈的成血管細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞和管周間質(zhì)細(xì)胞上，然而EphB4顯著地表達(dá)在靜脈系統(tǒng)。在胚胎中，EphB4表達(dá)細(xì)胞與EphrinB2表達(dá)細(xì)胞相互作用來引導(dǎo)細(xì)胞的定位和模式的形成。在毛細(xì)血管水平，動脈內(nèi)皮細(xì)胞上的EphrinB2與靜脈內(nèi)皮細(xì)胞上的EphB4相互作用，在血管的成熟和分布中建立了一個分級模式。EphB4/EphrinB2在成人脈管系統(tǒng)中的生理功能目前還不明確，但它們結(jié)合會導(dǎo)致受體聚集并激活受體信號通道，可能在組織損傷中的生理性血管生成和病理性的傷口愈合中起著重要的指引和定位作用。靶向性地破壞Ephrin或Eph受體可以減少血管生成[18]。

在反復(fù)認(rèn)真做好外業(yè)工作基礎(chǔ)上，對輸水管路走向、平面布置位置、管床開挖斷面尺寸控制、細(xì)部結(jié)構(gòu)（鎮(zhèn)墩、支墩、橋涵、樁基、?？驳龋┰O(shè)計、管道連接件（閘閥、排氣閥、沖沙閥、拍門、彎管接頭、三通管、連通管、伸縮節(jié)等）、管道墊層、管道回填等項目作出科學(xué)合理的設(shè)計，經(jīng)審查后確定宏觀的管道規(guī)劃設(shè)計方案，對局部性的規(guī)劃設(shè)計調(diào)整和變更可轉(zhuǎn)入實施階段進(jìn)行修改和完善。

生理狀態(tài)下，血管內(nèi)皮細(xì)胞、周細(xì)胞、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞、膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞均可表達(dá)低水VEGF，提示生理狀態(tài)下VEGF不僅在胚胎早期階段介導(dǎo)正常視網(wǎng)膜血管的發(fā)育、成熟及完善，可能對于出生后維持正常機(jī)體視網(wǎng)膜神經(jīng)及血管的完整性亦發(fā)揮一定的作用[19]。長期的高血糖致視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮損傷，毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，血管滲漏、閉塞，缺氧的網(wǎng)膜組織釋放出血管增殖物質(zhì)，促使新生血管形成，進(jìn)而導(dǎo)致發(fā)生出血、機(jī)化，而發(fā)生增殖性病變[20]。VEGF能特異性作用于視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞，可能是最直接的眼內(nèi)新生血管形成因子。

本研究將所有DR兔的右眼作為藥物干預(yù)組，為藥物干預(yù)組，分別予sEphB4 200、500、1000μg各50μL玻璃體腔注入。左眼作為對照組，予以生理鹽水50μL玻璃體腔注入。每月注射1次，治療6個月后，應(yīng)用檢測兔眼視網(wǎng)膜及玻璃體增殖膜EphB4、EphrinB2和VEGF的表達(dá)。結(jié)果顯示，隨著sEphB濃度的不斷增加，EphB4、EphrinB2、VEGF水平逐漸降低，且均明顯低于對照組（P＜0.01），從而證實sEphB4可抑制糖尿病視網(wǎng)膜病變兔視網(wǎng)膜新生血管內(nèi)皮細(xì)胞EphB4/EphrinB2和VEGF的表達(dá) 。

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