ANKRD55基因單核苷酸多態(tài)性與漢族類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的相關(guān)性研究

陳新鵬 李 靜 尹志華 曾惠瓊 何偉珍 葉志中

深圳市福田區(qū)風(fēng)濕病專科醫(yī)院，廣東深圳 518040

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）是最常見的風(fēng)濕性疾病之一，病因未明，目前研究認(rèn)為RA的發(fā)病是由遺傳和環(huán)境因素相互作用的結(jié)果，遺傳學(xué)因素可以解釋RA大約50%的易感性[1]。RA是一個具有復(fù)雜遺傳背景的多基因病，目前已經(jīng)有很多關(guān)于RA與基因關(guān)聯(lián)度的研究報道，但是特異性基因還沒有得到驗證，分辨出每個疾病相關(guān)易感基因?qū)﹃U明類RA的發(fā)病機制，發(fā)現(xiàn)可以用于臨床的生物標(biāo)記，尋找可能的基因治療靶點，對于改變目前RA的診治水平至關(guān)重要[2]。

最近研究發(fā)現(xiàn)ANKRD55基因rs 6859219位點基因多態(tài)性可能是RA的重要的候選易感基因，研究發(fā)現(xiàn)該基因的歐美血統(tǒng)的RA易感性相關(guān)[3]。但目前未有針對中國人群進行進行相關(guān)研究的報道[4]，另外相關(guān)研究顯示，某些基因位點與RA自身抗體和某些細胞因子的產(chǎn)生、病情活動度也有一定相關(guān)性，所以本研究旨在探討漢族人群ANKRD55基因rs 6859219位點基因多態(tài)性與RA易感性的相關(guān)性，以及這一基因位點多態(tài)性與自身抗體和多種細胞因子的表達的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年3～12月在深圳市福田區(qū)風(fēng)濕病專科醫(yī)院就診的153例漢族（根據(jù)患者身份證的民族資料）RA患者，均符合1987年ACR的診斷標(biāo)準(zhǔn)。RA組153例，平均年齡52.7歲，女129例，男24例；健康對照組130例，平均年齡49.3歲，女107例，男23例，排除急性感染、糖尿病、心腦血管疾病、肝腎疾病等疾病。兩組之間性別、年齡等一般資料比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。本研究經(jīng)過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，并與研究對象簽訂知情同意書。

1.2 方法

乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝外周靜脈血5mL，按酚－氯仿方法提取DNA。用TaqManTM SNP Genotyping試劑采用熒光PCR方法測定樣本中的SNP，反應(yīng)條件：50℃ 2min 1個循環(huán)，95℃ 10min 1個循環(huán)，95℃ 15s 40個循環(huán)，在60℃處收集熒光。反應(yīng)體系為20μL體系，反應(yīng)體系為20μL體 系，由 1μL的 Taqman-MGB、10μL的 Master Mix、8μL的H2O以及1μL的樣本DNA組成。用ELISA方法檢測血清中的IL-1α（interleukin 1α，白 介 素 1α）、TNF-α（tumor necrosis factor α，腫瘤壞死因子 α）、IL-4（interleukin 4，白介素4）、IL-10（interleukin 10， 白 介 素 10）、TGF-β（transforming growth factor β， 轉(zhuǎn) 化 生 長 因 子β）、抗 CCP抗 體（anti-cyclic citrullinated peptide antibody，抗環(huán)瓜氨酸肽抗體）、抗GPI抗體（Glucose 6 phosphate isomerase，葡萄糖6磷酸異構(gòu)酶）；免疫比濁法檢測CRP（c reactive protein，C反應(yīng)蛋白）、RF（rheumatoid factors，類風(fēng)濕因子）；魏氏法檢測ESR（erythrocyte sedimentation rate，紅細胞沉降率）。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS22.0軟件包對實驗數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。首先用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗，檢測所收集的數(shù)據(jù)是否代表群體的基因分布。然后分析數(shù)據(jù)是否屬于正態(tài)分布，符合正態(tài)分布的計數(shù)資料以（±s）表示，變量間相關(guān)性分析采用pearson相關(guān)性分析；不符合正態(tài)分布資料，兩組間比較用非參數(shù)檢驗兩個獨立樣本的秩和檢驗（Mann-Whitney U檢驗），多組間采用χ2檢驗進行差異性比較；變量間相關(guān)性分析采用Spearman相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RA組和健康對照組ANKRD55 rs 6859219的SNP基因型的頻率分布

ANKRD55 rs 6859219在RA患者DNA中的表達與健康對照組相比，運Taqman-MGB探針的方法得出結(jié)果，見表1。運用Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗方法得出兩組比較P＞0.05，說明樣本人群該基因頻率符合遺傳平衡法則，見表2。用SPSS.22對RA組與健康組進行卡方檢驗的差異性比較，P＞0.05，df=1，說明兩組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

表1 ANKRD55 rs 6859219實驗結(jié)果統(tǒng)計

表2 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗方法

2.2 RA組ANKRD55 rs 6859219 SNP基因型與自身抗體（RF、GPI、CCP）、炎癥物質(zhì)（CRP、ESR）、細胞因子（IL-1α、IL-6、TNF-α、IL-4、IL-10、TGF-β）的相關(guān)性分析

采用SPSS.22的Spearman相關(guān)性分析，ANKRD55 rs6859219 SNP基 因 型 與 CRP、ESR、RF、GPI、CCP、IL-1α、IL-6、TNF-α、IL-4、IL-10、TGF-β均無相關(guān)性，P＞0.05。見表3。

3 討論

20世紀(jì)70年代研究者鑒定出了首個與RA相關(guān)的基因HLA-DRBl[5]。1987年Gregersen等[6]提出著名的“共同表位”學(xué)說，進一步揭示了遺傳因素與RA發(fā)病的重要關(guān)聯(lián)性。近年來，隨著全基因組關(guān)聯(lián)分析（GWASs）等高通量測序技術(shù)的出現(xiàn)，RA的遺傳病因機制研究取得了較大的成果。單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）是指DNA序列上發(fā)生的單個核苷酸堿基之間的變異，是廣泛存在基因組中的一種變異形式，約占人類基因組中遺傳多態(tài)性的90%。目前SNP檢測技術(shù)在人類疾病的研究中得到廣泛應(yīng)用，特別是在多基因復(fù)雜疾?。ㄈ缒[瘤、風(fēng)濕病等）遺傳易感性的探討上。至今為止，已明確與RA相關(guān)的SNP位點有 40 余個[7]，包括 HLA-DRB1、KIRs[8]、PTPN22[9]、STAT4、PADI4[10]等，為疾病的發(fā)病機制研究和風(fēng)險預(yù)測提供了依據(jù)，對RA發(fā)病機制及藥物開發(fā)等研究具有重大的意義。但是，SNP的基因多態(tài)性受不同人種、不同區(qū)域等影響而不同[11]。

表3 ANKRD55 rs6859219 SNP基因型與各細胞因子之間的相關(guān)性分析

ANKRD55基因定位于染色體5q11.2，是一個錨蛋白重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域（ankyrin repeat domain，ARD）基因，編碼錨蛋白重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)55，具體功能目前未知。錨蛋白重復(fù)序列（ankyrin repeat， ANK）是一種蛋白質(zhì)序列模體，在ANK結(jié)構(gòu)域（即ARD）中折疊成β2α2結(jié)構(gòu)，多個ANK通過β片層或α螺旋形成一個具有親水及疏水兩種相反性質(zhì)的螺旋平面。每一個ARD中ANK模體能夠與多種不同的的配體結(jié)合，介導(dǎo)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的相互作用，從而實現(xiàn)其生物功能的多樣性及復(fù)雜性[12]。目前已有報道的生物學(xué)功能包括細胞周期調(diào)節(jié)功能、轉(zhuǎn)錄活性調(diào)節(jié)的功能、腫瘤抑制作用、促進細胞的發(fā)生和分化、促進細胞黏附和細胞骨架形成等[13]。研究顯示，錨蛋白重復(fù)序列結(jié)構(gòu)域蛋白質(zhì)的DNA序列突變與一系列自身免疫相關(guān)性疾病相關(guān)，報道顯示與裸淋巴細胞綜合征[14]、幼年特發(fā)性關(guān)節(jié)炎[15]，2型糖尿?。ㄟ€與胰島素抵抗相關(guān)）[16]、多發(fā)性硬化（MS）等疾病相關(guān)[17]。2010年Stahl EA等發(fā)表他們的針對歐洲血統(tǒng)的GWAS結(jié)果，結(jié)果表明ANKRD55基因 SNPrs6859219與RA具有相關(guān)性[3]。隨后Viatte S等[18]發(fā)表了仍然是針對歐洲血統(tǒng)的RA患者擴大樣本的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該SNP位點與RA具有相關(guān)性，而且進一步證實不管抗環(huán)瓜氨酸抗體是否陽性，RA患者與該基因位點都有相關(guān)性。Eyre S等[19]2013年報道了他們使用SNP陣列免疫芯片檢測分析了歐洲RA患者，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該基因SNP與RA相關(guān)聯(lián)。但尚未見到針對中國人群的研究報道。

我們首次進行該基因SNP與中國漢族RA患者的關(guān)聯(lián)研究，結(jié)果顯示，在RA組與對照組的ANKRD55 rs 6859219的連鎖不平衡性和SNPs與RA的相關(guān)性分析中，所選擇的RA組樣本符合Hardy-Weinberg遺傳平衡，P＞0.05。組間基因型及等位基因的比較采用SPSS.22軟件的卡方檢驗的差異性比較，自由度為1，P＞0.05，說明兩組差異無統(tǒng)計學(xué)意義。這與Viatte S 及Stahl等研究結(jié)果不同，未能證實ANKRD55 rs 6859219基因多態(tài)性與漢族RA患者易感性存在關(guān)聯(lián)。分析上述結(jié)果，一種可能是兩者確實沒有相關(guān)性，因為基因多態(tài)性受種族、地域等多方面的影響；二是因為所收集樣本例數(shù)不足，并不能代替所有的中國漢族人群，有必要擴大樣本進一步研究。

目前認(rèn)為RA的發(fā)病機制涉及多種細胞因子，如 TNF-α、IL-1α、IL-6、IL-4、IL-10、TGF-β[20]。臨床上采用生物制劑治療就是在對細胞因子研究發(fā)展起來的，而TNF-α、IL-1及IL-6拮抗劑等治療RA取得良好效果就是對細胞因子在疾病過程中充當(dāng)重要角色最好的證明[21]。其中TNF-α、IL-1、IL-6在RA的發(fā)病及發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用，是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)、組織損傷、免疫反應(yīng)的主要介質(zhì)之一。IL-4、IL-10作為抑炎因子，也參與發(fā)病調(diào)控過程。TGF-β廣泛來源于成纖維細胞、單核細胞及T細胞等，與基質(zhì)維持、纖維化等過程相關(guān)。細胞因子的產(chǎn)生、表達水平、在體內(nèi)存在持續(xù)時間等也受基因調(diào)控，如細胞因子啟動子序列多態(tài)性，啟動子多態(tài)性的不同可使細胞因子表達不同，可使用抗感染力選擇性增強，也可能引起或加重自身免疫性疾病[22-23]。但本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞因子IL-1α，IL-6，TNF-α，IL-4，IL-10，TGF-β 與 ANKRD55 rs 6859219基因多態(tài)性采用Spearman相關(guān)分析結(jié)果，無明顯相關(guān)性（P＞0.05）。

RA患者還會產(chǎn)生多種自身抗體，如RF，早在1931年Cecil及其同事首先發(fā)現(xiàn)了RA患者血清的凝集作用，后續(xù)1940年Waller發(fā)現(xiàn)RA患者體內(nèi)存在的凝集激活因子，1949年P(guān)ike將這種首先在RA患者身上發(fā)現(xiàn)的凝集激活因子命名為類風(fēng)濕因子并沿用至今。20世紀(jì)90年代末又發(fā)現(xiàn)瓜氨酸是RA血清抗聚角蛋白微絲蛋白相關(guān)抗體識別的主要組成性抗原決定簇成分，因此人工合成抗環(huán)瓜氨酸多肽抗體（抗CCP抗體），相對RF，抗CCP抗體特異性明顯增高[24]。Kroot等[25]臨床觀察認(rèn)為，抗CCP抗體陽性的RA患者骨破壞程度較陰性患者更嚴(yán)重，預(yù)后更差。GPI也被發(fā)現(xiàn)與關(guān)節(jié)炎相關(guān)，存在于RA患者，可能與局部補體沉積和炎癥反應(yīng)相關(guān)。臨床上可以發(fā)現(xiàn)，不是每個RA患者都會出現(xiàn)上述所有抗體陽性，后經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，抗體的產(chǎn)生也與基因多態(tài)性相關(guān)。如Van Gaalen等[26]研究發(fā)現(xiàn)抗CCP抗體與RA的HLA-II易感基因有相關(guān)性，并預(yù)示著疾病的嚴(yán)重度。而ESR、CRP作為臨床診斷及病情評估指標(biāo)。RA患者的基因信息的有效性因大范圍的GWAS得到了大幅度的增長，同樣也將單核苷酸多態(tài)性（SNP，未成年人的等位基因頻率＞5%）與病情活動的RA患者的風(fēng)險性聯(lián)系起來。在某些情況下，病情活動的RA患者的遺傳變異是和某些特定的原始群體聯(lián)系在一起的，而不能轉(zhuǎn)移給其他的種群，這就是疾病基因異質(zhì)性的一個明確的跡象。但本組臨床資料結(jié)果分析，未發(fā)現(xiàn)RF、CCP、GPI、CRP、ESR與ANKRD55 rs 6859219基因多態(tài)性之間的相關(guān)性。

綜上所述，基因的單核苷酸多態(tài)性與RA的發(fā)病的相關(guān)性是目前的熱點研究，ANKRD55 rs 6859219在歐洲人群中被證實與RA的發(fā)病可能有關(guān)，但在本實驗中未證實中國漢族人群與這個基因位點多態(tài)性有關(guān)聯(lián)性，且與自身抗體、細胞因子、病情活動等也無明顯相關(guān)，除了不同人種之間的差異，樣本量少也可能是原因之一，有必要擴大樣本進一步研究。此實驗將為我們繼續(xù)探索漢族人群中與RA的發(fā)病有關(guān)的基因位點起重大參考作用，以便進一步深入研究的開展。

[參考文獻]

[1] Scott DL，Wolfe F，Huizinga TW.Rheumatoid arthritis [J].Lancet，2010，376（9746）：1094-1108．

[2] 談文峰，王芳，張繆佳等.運用基因芯片初步研究類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者外周血單個核細胞基因表達譜特征[J].中華風(fēng)濕病學(xué)雜志，2006，10（12）：745-750.

[3] Stahl EA，Raychaudhuri S，Remmers EF，et al.Genomewide association study meta-analysis identifies seven new rheumatoid arthritisrisk loci[J].Nat Genet，2010，42（6）：508-514.

[4] 潘寶龍，張園園，巫玲，等.類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎易患基因研究進展 [J].醫(yī)學(xué)綜述，2017， 23（3）：437-441.

[5] Stastny P.Association of the B-cell alloantigen DRw4 with rheumatoid arthritis [J].New England Journal of Medicine，1978，298（16）：869-871．

[6] Gregersen P，Silver J，Winchester R.The shared epitope hypothesis.An approach to understanding the molecular genetics of susceptibility to rheumatoid arthritis [J].Arthritis& Rheumatism，1987，30（11）：1205-1213.

[7] Raychaudhuri S.Recent advances in the genetics of rheumatoid arthritis [J].Curr Opin Rheumatol，2010，22（2）：109-118.

[8] Li X，Xia Q，F(xiàn)an D，et al.Association between KIR gene polymorphisms and rheumatoid arthritis susceptibility： A meta-analysis[J].Hum Immunol，2015，76（8）：565-570.

[9] Ikari K，Momohara S，Inoue E，et al.Haplotype analysis revealed no association between the PTPN22 gene and RA in a Japanese population[J].Rheumatology（Oxford），2006，45（11）：1345-1348.

[10] Lee YH，Rho YH，Choi SJ，et al.PADI4 polymorphisms and rheumatoid arthritis susceptibility a meta-analysis[J].Rheumatol Int，2007，27（9）：827-833.

[11] Yamamoto K，Okada Y，Suzuki A，et al.Genetics of rheumatoid arthritis in Asia- present and future[J].Nat Rev Rheumatol，2015 Jun；11（6）：375-379.

[12] Mosavi LK，Cammett TJ，Desrosiers DC，et al.The ankyrin repeat as molecular architecture for protein recognition[J].Protein Sci，2004，13（6）：1435-1448.

[13] Li J，Mahajan A，Tsai MD，et al.Ankyrin repeat： a unique motif mediating protein-protein interactions[J].Biochemistry，2006， 45（51）：15168-15178.

[14] Alloza I，Otaegui D，de Lapuente AL，et al.ANKRD55 and DHCR7 are novel multiple sclerosis risk loci[J].Genes Immun，2012，13（3）：253-257.

[15] Reinards TH，Albers HM，Brinkman DM，et al.CD226（DNAM-1） is associated with susceptibility to juvenile idiopathic arthritis[J].Ann Rheum Dis，2015， 74（12）：2193-2198.

[16] Harder MN，Ribel-Madsen R，Justesen JM， et al. Type 2 diabetes risk alleles near BCAR1 and in ANK1 associate with decreased β-cell function whereas risk alleles near ANKRD55 and GRB14 associate with decreased insulin sensitivity in the Danish Inter 99 cohort[J].J Clin Endocrinol Metab，2013，98（4）：E801-806.

[17] Lill CM，Schjeide BM，Graetz C，et al.Genome-wide significant association of ANKRD55 rs6859219 and multiple sclerosis risk[J].J Med Genet，2013，50（3）：140-143.

[18] Viatte S，Plant D，Bowes J，et al.Genetic markers of rheumatoid arthritis susceptibility in anti-citrullinated peptide antibody negative patients[J].Ann Rheum Dis，2012，71（12）：1984-1990.

[19] Eyre S，Bowes J，Diogo D，et al.High-density genetic mapping identifies new susceptibility loci for rheumatoid arthritis[J].Nat Genet，2012，44（12）：1336-1340.

[20] 徐曉玲，梁瑞霞，黃君健，等.細胞因子在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制中的作用[J].生物技術(shù)通訊，2008，19（1）：111-114。

[21] 鄭文潔，曾小峰.生物制劑在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的應(yīng)用與進展[J].臨床藥物治療雜志，2014，12（4）：1-7.

[22] Hajeer AH，Hutchinson IV.TNF-alpha gene polymorphism：clinical and biological implications[J].Microsc Res Tech 2000，50（3）：216-228.

[23] Hurme M，Lahdenpohja N，Santtila S.Gene polymorphisms of interleukins 1and 10 in infectious and autoimmune diseases[J].Ann Med，1998，30（5）：469-473.

[24] Union A，Meheus L，Humbel RL，et al.Identificaton of Citrullinated rheumatoid arthritis-specific epitopes in natural filaggrin felevant for antifilaggrin autoantibody detection by line immunoassay[J].Arthritis Rheum，2002，46（5）：1185-1195.

[25] Corr M，F(xiàn)irestcin GS.Innated immunity as a hired gun：But is it rehematoid arthritis[J].J Exp Med， 2002， 195（8）：33-35.

[26] Van Gaalen FA，Van Aken J，Huizinga TW，et al.Association between HLA class II genes and autoantibodies to cyclic citrullinated peptides（CCPs）influences the severity of rheumatoid arthritis[J].Arthritis Rheum，2004，50（7）：2113-2121.