超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定蜂蜜中抗生素和農(nóng)藥濃度

汪建妹,楊華,曾銀歡,吳俐勤,李銳,袁玉偉,錢鳴蓉

(浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)院 農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究所， 浙江 杭州 310014)

蜂蜜具有抗氧化性、抗菌性、提高免疫力等生物活性，是一種食療佳品和天然藥品，不僅有調(diào)節(jié)機(jī)體生理機(jī)能、消除疲勞、抗衰老等功效，而且還可以輔助治療和抵抗多種疾病，促進(jìn)人們健康長壽. 目前我國以農(nóng)戶散養(yǎng)的傳統(tǒng)養(yǎng)蜂方式為主，當(dāng)蜜蜂感染疾病或受到害蟲侵害時，蜂農(nóng)為了控制病害而出現(xiàn)濫用抗生素和農(nóng)藥的情況. 同時，蜜源作物上使用的農(nóng)藥也可能通過蜜蜂的采蜜遷移至蜂蜜中，導(dǎo)致蜂蜜中存在農(nóng)獸藥殘留. 國內(nèi)外均有文獻(xiàn)報道蜂蜜樣品中存在抗生素或農(nóng)藥殘留情況，如CUI 等[1]在蜂蜜樣品中檢出了諾氟沙星、環(huán)丙沙星和氧氟沙星，濃度分別為10.0，8.9，9.9 μg·L-1；LI等[2]采用氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法比較了2種不同的前處理分析方法測定蜂產(chǎn)品中的多種農(nóng)藥，并檢出了蠅毒磷，其濃度高達(dá)221.97 ng·kg-1(干重計); KUJAWSKI等[3]采用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定波蘭蜂蜜中13種農(nóng)藥，其中40種樣品檢出35種，甚至1種樣品中檢出了5種農(nóng)藥. 食用這些含農(nóng)獸藥殘留的蜂蜜，對人體健康存在潛在風(fēng)險，因此，蜂蜜質(zhì)量安全引起了人們的廣泛關(guān)注，需要對蜂蜜中的危害因子進(jìn)行風(fēng)險評估.

目前，蜂蜜中農(nóng)獸藥殘留的檢測技術(shù)主要有： 液相色譜法[4-5]、氣相色譜法[6]、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[7-10]、氣相質(zhì)譜色譜聯(lián)用法[12-13]、微生物法[14]、酶聯(lián)免疫法[15]、生物芯片技術(shù)[16]等. 其中，液質(zhì)技術(shù)、氣質(zhì)技術(shù)因其具有較高的靈敏度、準(zhǔn)確度和精確度，廣泛應(yīng)用于農(nóng)獸藥的多殘留檢測分析中. 蜂蜜中多殘留檢測前處理方法主要有液液萃取法、固相萃取法[8]、固相分散萃取法[7,9-10,12]等. 本研究采用通過式的固相萃取法快速凈化蜂蜜樣品，使用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測定39種抗生素和25種農(nóng)藥，操作簡單、快速方便、靈敏度高，與已報道的蜂蜜中多殘留檢測方法相比，本方法測定的藥物種類更多、涵蓋參數(shù)更全，且適合大批量樣品的篩查與監(jiān)測. 本方法監(jiān)測了市售蜂蜜樣品中的抗生素與農(nóng)藥殘留情況，并采用蒙特卡羅模擬分析法對蜂蜜中有害殘留因子進(jìn)行了風(fēng)險評估[17]，為居民膳食暴露風(fēng)險評估提供了科學(xué)的分析結(jié)果.

1 材料與方法

1.1 試劑材料與設(shè)備

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)： 39種抗生素： 氯霉素、螺旋霉素(SPI)、替米考星(TIL)、泰樂菌素(TYL)、竹桃霉素(OLE)、北里霉素(KIT)、紅霉素(ERY)、交沙霉素(JOS)、羅紅霉素(ROX)、恩諾沙星(ENR)、環(huán)丙沙星(CIP)、諾氟沙星(NOR)、氧氟沙星(OFL)、氟甲喹(FLU)、噁喹酸(OXO)、雙氟沙星(DIF)、沙拉沙星(SAR)、司帕沙星(SPA)、達(dá)氟沙星(DAN)、氟羅沙星(FLE)、馬坡沙星(MAR)、伊諾沙星(ENO)、奧比沙星(ORB)、吡哌酸(PIP)、培氟沙星(PEF)、洛美沙星(LOM)、西諾沙星(CIN)、萘啶酸(NAL)、甲硝唑(MNZ)、甲硝唑代謝物(MNZOH)、二甲硝咪唑(DMZ)、二甲硝咪唑代謝物(HMMNI)、洛硝噠唑(RNZ)、異丙硝唑(IPZ)、異丙硝唑代謝物(IPZOH)、土霉素(OTC)、四環(huán)素(TC)、金霉素(CTC)、強(qiáng)力霉素(DC)；25種農(nóng)藥： 吡螨胺(TBF)、噻螨酮(HTZ)、蠅毒磷(CMP)、噠螨靈(PDB)、克螨特(PPG)、螺螨酯(SPD)、唑螨酯 (FPM)、三環(huán)唑 (TCZ)，戊菌唑 (PCZ)，腈菌唑 (MCT)，環(huán)丙唑醇 (CPZ)，烯效唑 (UCZ)，多效唑 (PBZ)，三唑酮 (TDF)，三唑醇 (TDN)， 戊唑醇 (TBZ)，己唑醇 (HXZ)，氟硅唑 (FLZ)，滅菌唑 (TTZ)，氟環(huán)唑 (EPZ)，腈苯唑 (FBZ)，聯(lián)苯三唑醇 (BTT)，苯醚甲環(huán)唑 (DFZ)，糠菌唑同分異構(gòu)體 (BMZ)，純度均大于98%，Dr. Ehrenstorfer 公司，德國.

試劑材料： 乙腈和甲醇為色譜純(Merck)；甲酸為色譜純(中國華東醫(yī)藥公司)；Milli-Q system超純水儀(美國Millipore 公司)；Oasis PRiME HLB 固相萃取柱(6 cc 200 mg)(美國Waters公司).

儀器設(shè)備： 6500 Qtrap線性離子阱質(zhì)譜儀(美國AB公司)，超高壓液相色譜(島津，日本)配置SIL-30AC 自動進(jìn)樣器和 DGU-20A5r高壓泵.

1.2 試劑配制

準(zhǔn)確稱取按其純度折算為100%質(zhì)量的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各10.0 mg，分別用甲醇溶解并定容至50 mL，濃度為200 mg·L-1，儲備液于-20℃儲存，有效期為3個月. 用空白樣品提取液配成不同濃度的基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液于4℃保存，現(xiàn)配現(xiàn)用.

1.3 樣品前處理方法

準(zhǔn)確稱取1.0 g蜂蜜樣品于15 mL離心管中，加入5 mL乙腈+水(v/v=8: 2)，渦旋1 min，使樣品與提取試劑混勻. 然后離心管在7 000 r·min-1的轉(zhuǎn)速下離心5 min，取2.5 mL上清液過PRiME HLB柱，并接收流出液. 收集液經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜后，用UPLC-MS/MS進(jìn)行分析.

1.4 液質(zhì)分析條件

色譜柱： BEH C18柱 (2.1 mm×100 mm，1.7 μm) (Waters，USA)；柱溫： 40℃；流動相A： 2 mmol·L-1甲酸銨溶液(含0.1%甲酸)，流動相B： 甲醇(含2 mmol·L-1甲酸銨溶液+0.1%甲酸). 液相色譜梯度洗脫條件： 0～1.5 min，5% B；1.5～3.5 min，5%～25% B；3.5～5 min，25% B；5～9 min，80% B；9～14 min，80%～100% B；14～20 min，100% B；20～23 min，100%～5% B；23～25 min，5% B. 流速： 0.20 mL· min-1； 進(jìn)樣體積： 5 μL. 質(zhì)譜條件： ESI (+)，離子源溫度： 550℃，噴霧電壓： 5.5 kV；ESI (-)，離子源溫度： 400℃，噴霧電壓： -4.0 kV. 氣簾氣： 40 psi，gas1： 55 psi，gas2： 50 psi. 其他質(zhì)譜參數(shù)，如母離子(Q1)，子離子(Q3)，碰撞能量和去簇電壓見表1.

表1 64種化合物的質(zhì)譜參數(shù)

(續(xù)表1)

* 糠菌唑1和糠菌唑2分別表示在色譜柱上流出的1號異構(gòu)體和2號異構(gòu)體.

2 膳食暴露評估方法

運用軟件@Risk (Palisade Corporation, Version5.0，NY，USA)，采用Monte Carlo模擬法對蜂蜜中危險因子進(jìn)行評估，利用食品消費數(shù)據(jù)、消費者的生理數(shù)據(jù)和食品中有害因子的殘留濃度數(shù)據(jù)，計算暴露風(fēng)險值的范圍及概率分布，對蜂蜜中有害物質(zhì)進(jìn)行不確定性風(fēng)險評估. 危害因子日均膳食暴露量的計算公式為：

DIs = C×10-3×IR·BW-1，

其中，DI (mg·(kg·bw)-1·day-1)為每日暴露值，C(g·d-1) 為蜂蜜的日均攝入量，IR(mg·kg-1)為食品中危害因子的平均濃度，BW (kg) 為每個群組的平均體重，ADI為日均最大允許攝入值. 其中食品消費數(shù)據(jù)和居民的平均體重數(shù)據(jù)來源于《中國統(tǒng)計年鑒2012》中的中國居民膳食調(diào)查數(shù)據(jù).

3 結(jié)果與分析

3.1 樣品前處理

文中待測的多種殘留化合物極性差異較大，為了使所有目標(biāo)物均能被提取，需要用極性范圍較大的溶劑.乙腈和水的混合物能夠提供較大的極性范圍，因此本方法采用80%乙腈溶劑. 比較80%乙腈與添加了0.2%甲酸的溶劑對目標(biāo)化合物的提取效率. 當(dāng)添加濃度為100 μg·kg-1、提取劑為80%乙腈時，39種抗生素及25種農(nóng)藥的回收率均在70%～120%；當(dāng)提取劑為含0.2%甲酸的80%乙腈時，只有35種抗生素及20種農(nóng)藥的回收率在70%～120%，表明80%乙腈的回收率更好(見圖1)，因此選擇80%乙腈作為提取溶劑.

圖1 采用2種提取溶劑提取后的目標(biāo)物回收率分布圖Fig. 1 The target distribution of recovery with two kinds of extraction solvent

3.2 基質(zhì)效應(yīng)、線性范圍與檢出限

以定量離子對峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線. 取混合標(biāo)準(zhǔn)中間液，用80%乙腈溶液逐級稀釋配制濃度為0.01，0.05，0.1，0.5，1.0，5.0，10，50，100和200 μg·L-1的系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液；同時通過添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)于空白基質(zhì)中制備基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線，并與標(biāo)準(zhǔn)溶液曲線的響應(yīng)值進(jìn)行比較，分析基質(zhì)效應(yīng). 結(jié)果基質(zhì)校準(zhǔn)標(biāo)準(zhǔn)工作液斜率與溶劑標(biāo)準(zhǔn)工作液斜率的比值在0.75～1.15間，部分目標(biāo)物存在較大基質(zhì)效應(yīng).為確保定量準(zhǔn)確，用基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量.

氯霉素和大環(huán)內(nèi)酯類藥物濃度分別在0.02～200 μg·L-1和1.0～200 μg·L-1時線性關(guān)系良好，其他目標(biāo)物濃度在0.1～200 μg·L-1時線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r2>0.99.

基于目標(biāo)物在樣品中低檔濃度的添加回收試驗的定性和定量離子對響應(yīng)值，以S/N為3計算檢測限，S/N為10計算定量限. 硝基咪唑類藥物的檢出限為0.25～0.98 μg·kg-1，定量限為0.77～2.95 μg·kg-1；氯霉素的檢出限為0.02 μg·kg-1，定量限為0.1 μg·kg-1；喹諾酮類藥物的檢出限為0.15～1.03 μg·kg-1，定量限為0.5～3.1 μg·kg-1；大環(huán)內(nèi)酯類藥物的檢出限為0.03～3.8 μg·kg-1，定量限為0.1～11.5 μg·kg-1；四環(huán)素類藥物的檢出限為1.0～2.39 μg·kg-1，定量限為5.19～7.18 μg·kg-1；三唑類農(nóng)藥的檢出限為0.18～0.76 μg·kg-1，定量限為0.5～2.29 μg·kg-1. 詳見表2.

表2 方法驗證參數(shù)

(續(xù)表2)

3.3 方法的準(zhǔn)確度與精密度

對蜂蜜樣品進(jìn)行低、中、高3個水平的加標(biāo)添加回收試驗，以測定本方法的準(zhǔn)確度與精密度. 根據(jù)化合物的定量限，硝基咪唑類、喹諾酮類、氯霉素和三唑類加標(biāo)質(zhì)量濃度分別為5，25 和50 μg·kg-1，四環(huán)素類加標(biāo)質(zhì)量濃度分別為10，25 和50 μg·kg-1，大環(huán)內(nèi)酯類加標(biāo)質(zhì)量濃度分別為15，25 和50 μg·kg-1. 在3種濃度水平下，39種抗生素的回收率分別為72%～117%，73%～116% 和79%～119%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.1%～13.7%，1.1%～12.7% 和0.8%～10.2%. 在3種濃度水平下，25種農(nóng)藥化合物的回收率分別為73%～103%，72%～109% 和79%～115%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.8%～12.7%，1.7%～7.8%和 2.2%～9.7%(詳細(xì)見表3). 圖2為蜂蜜中39種抗生素和25種農(nóng)藥混合物的分離色譜圖.

表3 蜂蜜中3種濃度水平的回收率(n = 5)

(續(xù)表3)

3.4 實際樣品測定

52個蜂蜜樣品均購自浙江省各超市，其中，洋槐蜜18個、百花蜜20個、枇杷蜜14個. 蜂蜜樣品經(jīng)過1.3節(jié)中的前處理，經(jīng)LC-MS/MS測定，有9個蜂蜜樣品檢出有抗生素，檢出率為17.3%，未檢出農(nóng)藥. 其中3 個蜂蜜樣品(百花蜜、洋槐蜜、枇杷蜜各1個)檢出諾氟沙星，檢出濃度分別為1 486.3，32.3和31.3 μg·kg-1；2個蜂蜜樣品(百花蜜、枇杷蜜各1個)檢出環(huán)丙沙星，檢出濃度分別為5.9和215.1 μg·kg-1；4個蜂蜜樣品(洋槐蜜、百花蜜各2個)檢出羅紅霉素，檢出濃度分別為59.6，64.4和79.6，214.4 μg·kg-1.

3.5 膳食暴露評估

針對本實驗檢出的風(fēng)險因子，未查到羅紅霉素及諾氟沙星的ADI值. 在農(nóng)業(yè)部235號公告中僅查到恩諾沙星的ADI值為0.002 mg·(kg·bw)-1·day-1，其中環(huán)丙沙星是恩諾沙星的代謝物，一般以總體計，因此本文將恩諾沙星的ADI(0.002 mg·(kg·bw)-1·day-1)用于環(huán)丙沙星的風(fēng)險評估. 根據(jù)化合物結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的相似性，諾氟沙星和羅紅霉素的ADI值分別用與之結(jié)構(gòu)和性質(zhì)相似的恩諾沙星(ADI： 0.002 mg·(kg·bw)-1·day-1)和紅霉素(ADI： 0.0007 mg·(kg·bw)-1·day-1)代替進(jìn)行評估. 在概率模型評估分析中，將檢出樣品濃度作為輸入值，未檢出或低于定量限的樣品通常用LOQ/2作為輸入值，將檢出和未檢出樣品的輸入值經(jīng)@Risk軟件分析，可獲得不同年齡組群的暴露風(fēng)險.

表4～表6分別為浙江省不同年齡組人員對諾氟沙星、環(huán)丙沙星和羅紅霉素的概率風(fēng)險評估值. 其中，3種風(fēng)險因子在99.9th的位點，女性的膳食暴露風(fēng)險要高于男性，10歲以下群組的膳食暴露風(fēng)險要高于其他群組. 比較了3種風(fēng)險因子在99.9th位點的風(fēng)險值，其大小依次為諾氟沙星>羅紅霉素>環(huán)丙沙星，膳食暴露風(fēng)險最高分別出現(xiàn)在女性消費者和0～10歲群組，諾氟沙星為50.2% ADI，羅紅霉素為20.7% ADI，環(huán)丙沙星為7.3% ADI. 以上%ADI值均小于100，說明膳食暴露評估風(fēng)險水平尚可接受.

4 結(jié) 語

利用超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)結(jié)合通過式凈化方式，可快速有效地檢測蜂蜜中所含的多種抗生素及農(nóng)藥殘留. 該方法前處理過程簡單快速、經(jīng)濟(jì)高效. 通過對市售蜂蜜樣品進(jìn)行隨機(jī)抽樣檢測，利用@Risk定量風(fēng)險評估專用軟件對在蜂蜜中監(jiān)測到的抗生素殘留數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，并對其進(jìn)行膳食暴露評估，得到其ADI%小于100，不具有風(fēng)險. 鑒于在計算中忽略了不同有害因子的相互作用以及其他飲食攝入等不確定因素，因此對蜂蜜中危害因子的膳食暴露評估還需要進(jìn)一步研究，以確保蜂蜜的食用安全.

圖2 蜂蜜中39種抗生素及25種農(nóng)藥混合物的分離色譜圖Fig.2 The chromatograms of 39 kinds of antibiotics and 25 kinds of pesticides in honey

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夾纻胎輕巧、牢固，成型后不易變形、開裂，留存時間長。從工藝角度看，造型的自由度增加了，能夠制造更為豐富多樣的器型。夾纻器的出現(xiàn)是漆工藝的一次革命，也為漆器生產(chǎn)的興旺發(fā)達(dá)奠定了基礎(chǔ)。夾纻器最早出現(xiàn)在戰(zhàn)國時期，兩漢中期以后盛行起來，成為最常見的制胎方法。魏晉南北朝以來，常采用夾纻胎工藝制作佛像。塑造的佛像十分輕便，可以車載、人抬游行于街市，達(dá)到宗教宣傳的目的。遺憾的是，唐末武宗滅佛，大量夾纻造像遭到毀壞，也導(dǎo)致這項工藝的失傳。到了清代，福州沈紹安恢復(fù)了傳統(tǒng)的“纻胎”工藝，并在此基礎(chǔ)上創(chuàng)造出著名的“脫胎漆器”。

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