hsp90α基因四環(huán)素誘導(dǎo)調(diào)控表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及功能驗(yàn)證

尚冰清，周 丹，朱 宏，劉 昱，郭麗麗，湯仁仙，寇艷波

（徐州醫(yī)科大學(xué)，1.免疫與代謝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；2.臨床醫(yī)學(xué)系院，江蘇 徐州 221006）

基因的過(guò)表達(dá)和沉默是研究基因功能的重要手段。但是由于某些基因的編碼產(chǎn)物在特定的細(xì)胞時(shí)期對(duì)細(xì)胞具有毒性或其減少嚴(yán)重影響細(xì)胞正常生長(zhǎng)甚至導(dǎo)致細(xì)胞死亡，給這些基因生物學(xué)功能的闡明帶來(lái)的極大地困難。此外，隨著研究的深入，有報(bào)道表明某些基因表達(dá)水平的不同所引起的生物學(xué)表型也截然不同[1-2]。因此，可人工調(diào)控表達(dá)系統(tǒng)的建立對(duì)基因功能的研究將具有非常重要的意義。

近些年研究者們開發(fā)出了許多種類的可誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)，1995年由Gossen等[3]發(fā)現(xiàn)并改造的Tet-on系統(tǒng)尤為受關(guān)注。環(huán)境中沒(méi)有四環(huán)素（tetracycline，Tc）或其衍生物如強(qiáng)力霉素（doxycycline，DOX） 存在時(shí)下游基因處于表達(dá)抑制狀態(tài)，當(dāng)Tc或DOX存在時(shí)下游基因啟動(dòng)表達(dá)[4]。傳統(tǒng)的Tet-on系統(tǒng)具有可控性好、本底表達(dá)水平低、細(xì)胞毒性小等特點(diǎn)，但是它也存在一定的不足，如傳統(tǒng)的Tet-on系統(tǒng)為雙載體系統(tǒng)需要同時(shí)對(duì)TetR表達(dá)載體和目的基因表達(dá)載體同時(shí)進(jìn)行遺傳操作，并且目的基因過(guò)表達(dá)無(wú)法統(tǒng)一檢測(cè)或?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)。

熱休克蛋白90（heat shock proteins 90，HSP 90）在細(xì)胞中含量豐富，約占細(xì)胞蛋白總量的1%-2%，其靶蛋白多在細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)控及存活方面發(fā)揮著重要作用。研究發(fā)現(xiàn)HSP90α在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)量為正常細(xì)胞的2-10倍，例如：HBV相關(guān)性肝細(xì)胞癌，其含量的表達(dá)與腫瘤分級(jí)分期相聯(lián)系[5-6]，提示其與細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化密切相關(guān)，并且HSP90α已作為腫瘤標(biāo)記物應(yīng)用于癌癥的早期篩查。不同表達(dá)水平的HSP90α對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展的作用研究將一定程度上加深人們對(duì)肝癌發(fā)生機(jī)制的認(rèn)識(shí)。

該研究通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)雙載體逆轉(zhuǎn)錄病毒Tet-on系統(tǒng)的改造建立了單載體Tet-on系統(tǒng)，并在啟動(dòng)子下游引入增強(qiáng)綠色熒光蛋白（Enhancegreen Fluorescent Protein，EGFP）編碼基因使過(guò)表達(dá)的目的蛋白標(biāo)記EGFP標(biāo)簽，便于后續(xù)檢測(cè)和實(shí)時(shí)觀察。新的Tet-on-EGFP系統(tǒng)應(yīng)用于肝癌細(xì)胞HepG2中HSP90α的過(guò)表達(dá)，通過(guò)使用不同濃度DOX的誘導(dǎo)不同水平Hsp90α過(guò)表達(dá)，為進(jìn)一步機(jī)制研究提供了有力的遺傳操作工具。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

肝癌細(xì)胞HepG2（徐州醫(yī)科大學(xué)免疫與代謝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）；pRetroX-Tet-on雙載體系統(tǒng) （中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所）；限制性內(nèi)切酶及連接酶（Thermo Fisher Scientific）；質(zhì)粒提取試劑盒，PCR產(chǎn)物純化試劑盒，凝膠回收試劑盒 （Omega）；PCR試劑盒 （Takara）； DMEM培養(yǎng)基（Hyclone）；胎牛血清 （Serana）；Lipofectamine 2000 （Invitrogen）；嘌呤霉素 （Sigma）；強(qiáng)力霉素 （生工生物）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Takara）；熒光定量PCR試劑盒（Takara）；EGFP、GAPDH蛋白抗體 （Abcam）；ECL發(fā)光劑（Bio-Rad）；CCK-8試劑盒（日本同仁）；恒溫CO2培養(yǎng)箱（Thermo Fisher Scientific）；熒光顯微鏡（Olympus）。

1.2 HepG2細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2細(xì)胞于含有10% 胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基中，37℃，5% CO2，一般2-3天傳代一次。

1.3 單載體Tet-On-EGFP系統(tǒng)載體構(gòu)建

1.3.1 目的基因hsp90αORF的擴(kuò)增與純化 由NCBI基因庫(kù)中獲取hsp90α基因編碼序列。利用軟件Primer 5.0設(shè)計(jì)引物并分別在上游和下游引物5'端引入限制性內(nèi)切酶NotI和MluI識(shí)別位點(diǎn)及對(duì)應(yīng)的保護(hù)堿基，上游引物序列：5'AAGG AAAAAAGCGGCCGCATGCCCCCGTGTTCGGGCG 3'，下游引物序列：5' CGACGCGTTTAGACTACTTCTTCCATGC GTGATGTGTCG 3'。以肝癌細(xì)胞HepG2 cDNA為模板經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得hsp90α全長(zhǎng)基因片段（產(chǎn)物大小2579 bp）。利用純化試劑盒純化PCR產(chǎn)物，純化產(chǎn)物進(jìn)行電泳分析。

1.3.2 表達(dá)質(zhì)粒

pRetroX-Hsp90a-EGFP-Pur的構(gòu)建 以質(zhì)粒pcDNA3.1-EGFP為模板PCR擴(kuò)增EGFP編碼基因，通過(guò)MluI和EcoRI雙酶切連接連入pRetroX-Tight-Pur，獲得質(zhì)粒pRetroX-EGFPPur。將1.3.1中純化的PCR產(chǎn)物和pRetroX-EGFP-Pur用NotI和MluI雙酶切，連接獲得質(zhì)粒pRetroX-Hsp90a-EGFP-Pur，測(cè)序無(wú)誤后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.3 rtTA表達(dá)盒的擴(kuò)增和單質(zhì)粒Tet-on系統(tǒng)的構(gòu)建

以pRetroX-Tet-On Advanced為模板PCR 擴(kuò)增rtTA表達(dá)盒，并在其兩端引入限制性內(nèi)切酶BglII識(shí)別位點(diǎn)。將rtTA表達(dá)盒和pRetroX-Hsp90a-EGFP-Pur經(jīng)BglII酶切及去磷后連接獲得最終質(zhì)粒pRetroX-Hsp90a-EGFP-Tet-On。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及篩選

HepG2生長(zhǎng)至80%時(shí)利用Lipfectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后5 h更換含有10% 胎牛血清的培養(yǎng)基，并于48 h后胰酶消化重新接種于含有1 mg/ml 嘌呤霉素的新鮮培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選，能夠正常生長(zhǎng)的細(xì)胞即含有pRetroX-Hsp90a-EGFPTet-On質(zhì)粒。

1.5 RT-PCR

收集不同濃度DOX誘導(dǎo)后的HepG2細(xì)胞，提取RNA，取總RNA 1 μg進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄獲得總cDNA，以不同組的cDNA為模板利用Roche Light Cycler 480熒光定量PCR儀檢測(cè)hsp90α轉(zhuǎn)錄情況，內(nèi)參為β-actin，引物序列如下：5'GGCATCGTGATGGACTCCG 3'，5'GCTGGAAGGTGGACAGCGA 3' （β-actin）；5'T G C C T C T G G T G AT G A G AT G G T T 3' ，5'GGTGACTGACACTAAAGTCTTCCCC 3' （hsp90α）。

1.6 Western Blot

收集不同濃度DOX誘導(dǎo)后的HepG2細(xì)胞，RIPA裂解液裂解，BCA法測(cè)定蛋白濃度。每孔上樣總蛋白15 mg進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)印至PVDF膜后用5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，一抗室溫孵育2 h洗滌后二抗孵育1 h再次洗滌后檢測(cè)EGFP和內(nèi)參GAPDH強(qiáng)度。

1.7 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

HepG2細(xì)胞消化后血球板計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度至4×104個(gè)/ml，分為四組（分別加入DOX使終濃度為0，100，250，500 ng/mL）接種于96孔板中每孔100 μl，每組15孔（3個(gè)時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)5個(gè)平行），于0 h，24 h和48 h通過(guò)CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“±s”表示，多個(gè)樣本均數(shù)的比較用方差分析，P＜0.05為差異有顯著性意義。

2 結(jié) 果

2.1 單載體Tet-On-EGFP系統(tǒng)載體構(gòu)建

分別通過(guò)PCR擴(kuò)增EGFP編碼基因、HSP90α編碼基因、rtTA-Advanced表達(dá)盒，目的產(chǎn)物經(jīng)凝膠回收后依次進(jìn)行酶切、純化、連接得到目的基因表達(dá)載體pRetroX-Tet-On-Hsp90α-EGFP，如圖1所示，1、2、3泳道為PCR擴(kuò)增結(jié)果，Hsp90α編碼基因2565 bp，EGFP編碼基因1607 bp，rtTAAdvanced表達(dá)盒長(zhǎng)1525 bp。pRetroX-Tet-On-Hsp90α-EGFP通過(guò)ApaI限制性內(nèi)切酶消化驗(yàn)證，產(chǎn)生條帶分別為8247 bp和2666 bp和998 bp，載體測(cè)序無(wú)誤后用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1 目的片段PCR產(chǎn)物及限制性內(nèi)切酶酶切驗(yàn)證瓊脂糖凝膠電泳1、2、3泳道分別為Hsp90α編碼基因、EGFP編碼基因、rtTAAdvanced表達(dá)盒，4泳道為pRetroX-Tet-On-Hsp90α-EGFP經(jīng)ApaI酶切結(jié)果，M泳道為Marker。

2.2 DOX誘導(dǎo)目的蛋白的表達(dá)

通過(guò)脂質(zhì)體法將目的基因表達(dá)載體pRetroX-Tet-On-Hsp90α-EGFP轉(zhuǎn)染至HepG2細(xì)胞中，經(jīng)G418（500 μg/ml）篩選后得到穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，分別添加終濃度為0，100，500，2500 ng/ml的DOX誘導(dǎo)基因表達(dá)，24 h后通過(guò)熒光顯微鏡、熒光定量PCR以及Western blot檢測(cè)EGFP和目的蛋白的表達(dá)，并比較不同濃度DOX誘導(dǎo)能力的差異。如圖2A所示，轉(zhuǎn)染基因表達(dá)載體pRetroX-Tet-On-Hsp90α-EGFP的HepG2細(xì)胞添加DOX誘導(dǎo)24 h后能夠觀察到明顯的綠色熒光，而未添加DOX基本無(wú)熒光，同樣Western blot結(jié)果表明EGFP隨DOX濃度不同出現(xiàn)表達(dá)量的差異，DOX為500 ng/ml時(shí)EGFP表達(dá)量最高（圖2B）。與之相一致的是，熒光定量PCR結(jié)果表明隨著DOX存在時(shí)hsp90α存在明顯的誘導(dǎo)表達(dá)現(xiàn)象，且500 ng/mL誘導(dǎo)作用最強(qiáng)（圖2C）。

2.3 hsp90α表達(dá)水平影響HepG2增殖

為進(jìn)一步檢測(cè)，不同濃度DOX誘導(dǎo)Hsp90α表達(dá)對(duì)HepG2增殖的影響，進(jìn)行了CCK-8實(shí)驗(yàn)。穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pRetroXTet-On-Hsp90α-EGFP的HepG2細(xì)胞消化后調(diào)整細(xì)胞濃度，分為四組，接種于96孔板中分別用不同濃度DOX誘導(dǎo)，每隔24 h利用CCK-8試劑盒檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。由圖3可知，未經(jīng)DOX誘導(dǎo)前，四組細(xì)胞數(shù)目基本一致，誘導(dǎo)48 h后添加500 ng/ml或2500 ng/ml DOX組增殖明顯高于對(duì)照，而100 ng/ml DOX組與對(duì)照組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說(shuō)明Hsp90α促進(jìn)HepG2增殖具有一定的劑量依賴性。

圖2 DOX誘導(dǎo)后目的蛋白表達(dá)檢測(cè)。

圖3 CCK-8檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。

3 討 論

大量研究已證實(shí)：四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)能夠有效降低基因泄露[7-8]、時(shí)間空間特異性調(diào)控基因表達(dá)[9]，且相對(duì)于其他系統(tǒng)的誘導(dǎo)因子如熱休克、激素，Tc作為抗生素對(duì)細(xì)胞毒性小，誘導(dǎo)所需的劑量低，可應(yīng)用于長(zhǎng)期調(diào)控表達(dá)的細(xì)胞、動(dòng)物模型。

四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)包括Tet-on與Tet-off系統(tǒng)。該實(shí)驗(yàn)選擇Tet-on系統(tǒng)，在有DOX時(shí)，tetR可與tetO結(jié)合目的基因得到表達(dá)，撤去dox 轉(zhuǎn)錄即被抑制[10]。由于活體攝取要比清楚快得多，因此其在基因轉(zhuǎn)錄方面要快于Tet-off系統(tǒng)。

相比較于傳統(tǒng)的Tet-on系統(tǒng)，需要兩次篩選轉(zhuǎn)染，操作繁瑣，該實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的Tet-on單質(zhì)粒載體系統(tǒng)，經(jīng)一次轉(zhuǎn)染即可用于實(shí)驗(yàn)，操作相對(duì)簡(jiǎn)單。在啟動(dòng)子下游引入EGFP編碼序列使過(guò)表達(dá)的目的蛋白C端標(biāo)記EGFP標(biāo)簽，便于后續(xù)檢測(cè)和實(shí)時(shí)觀察。不同濃度DOX展現(xiàn)出不同水平的誘導(dǎo)能力，一定程度上可用于某些蛋白的定量表達(dá)，為這些蛋白生物學(xué)功能的揭示提供了更有力的工具。

臨床統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明HSP90α與肝癌的發(fā)生具有明顯的相關(guān)性，其在腫瘤細(xì)胞的增殖和分化、生存和移動(dòng)及血管形成中發(fā)揮重要作用[11]。有研究表明，腫瘤細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)的HSP90α通過(guò)外泌體分泌于細(xì)胞外，與底物蛋白結(jié)合，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲遷移，在腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中發(fā)揮作用。其中，基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）是腫瘤細(xì)胞外HSP90α的底物之一，分泌于細(xì)胞外的 HSP90α可能通過(guò)激活其底物蛋白MMP-2增強(qiáng)肝癌細(xì)胞侵襲遷移能力。同時(shí)，HSP90α也可以與其他伴侶分子聯(lián)合作用，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，HSP90α和HSP70可能通過(guò)結(jié)合形成復(fù)合體調(diào)控MMP-2的成熟和活化，參與肝癌轉(zhuǎn)移潛能的形成[12]。HSP90α也可以通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期促進(jìn)細(xì)胞增殖。腫瘤細(xì)胞在低氧、營(yíng)養(yǎng)缺乏微環(huán)境中生存尤其依賴HSP90α。Hsp90α參與低氧誘導(dǎo)因子的信號(hào)傳導(dǎo)通路。HSP90α可作為一種正向調(diào)節(jié)因子參與血管再生[13]。

繼2013年在世界上首次證明HSP90α是一個(gè)全新腫瘤標(biāo)志物并可用作肺癌檢測(cè)后，清華大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院羅永章團(tuán)隊(duì)在世界上首次證明，HSP90α可用于肝癌患者的檢測(cè)，靈敏度比現(xiàn)行檢測(cè)方法甲胎蛋白（AFP）大幅提高。目前，這一發(fā)現(xiàn)已被國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局批準(zhǔn)臨床使用[14]。除此之外，亦有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，HSP90α高表達(dá)與肝癌分化程度相關(guān)，而與患者性別、病理類型、病理分期無(wú)關(guān)。楊婧[15]等證明HSP90α單克隆抗體不僅能明顯抑制肝癌移植瘤生長(zhǎng)，而且具有抑制肝癌干細(xì)胞侵襲、成球和耐藥的能力。說(shuō)明HSP90α在腫瘤干細(xì)胞侵襲和存活過(guò)程中起重要作用，具有作為肝癌干細(xì)胞治療靶點(diǎn)的潛力。

臨床統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明Hsp90α與肝癌的發(fā)生具有明顯的相關(guān)性，且Hsp90α已作為腫瘤標(biāo)記物用于肝癌早期的篩查。雖然已有研究提示Hsp90α高表達(dá)能夠促進(jìn)肝癌細(xì)胞侵襲和增殖[16]，但是并沒(méi)有進(jìn)一步研究揭示Hsp90α表達(dá)量與肝癌細(xì)胞侵襲和增殖的具體關(guān)系。該研究結(jié)果顯示hsp90α轉(zhuǎn)錄上調(diào)可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞HepG2的增殖，且增殖能力與hsp90α表達(dá)量存在一定的正相關(guān)關(guān)系，具體的分子機(jī)制還有待于深入探討。

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