高效液相色譜法分析新型細(xì)菌多糖中單糖和糖醛酸組成

王鳳芹， 張 林， 路則慶， 汪以真*

(浙江大學(xué)飼料科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)部華東動物營養(yǎng)與飼料重點(diǎn)實驗室，浙江省飼料及動物營養(yǎng)研究實驗室，浙江杭州 310058)

多糖的生物活性與其結(jié)構(gòu)密切相關(guān)，因此了解多糖的結(jié)構(gòu)有助于更好地利用和開發(fā)多糖。完整的多糖結(jié)構(gòu)分析是在將多糖進(jìn)行提取、分離、純化獲得均一性組分后，進(jìn)行包括分子量范圍、單糖的組成、連接類型、單糖和糖苷鍵的構(gòu)型及重復(fù)單元等的分析[1]。細(xì)菌多糖通常是由雙糖至八糖形成的規(guī)則的重復(fù)單位構(gòu)成，而這些重復(fù)單位則是由2～4種單糖所組成，其中許多糖鏈上又?jǐn)y帶有乙酰、丙酮酸、糖醛酸等特征基團(tuán)[2]。在多糖的結(jié)構(gòu)研究中，單糖組成分析是必不可少的環(huán)節(jié)。糖類物質(zhì)在紫外區(qū)無吸收，采用示差折光檢測的靈敏度低且不利于梯度洗脫。為此，在進(jìn)行高效液相色譜(HPLC)分析時，常采用衍生化處理，將糖類組分轉(zhuǎn)變?yōu)閹Оl(fā)色基團(tuán)的分子[3 - 4]，主要的衍生化試劑有1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)[5 - 6]、1-(2-萘基)-3-甲基-5-吡唑啉酮(NMP)[7]、對氨基苯甲酸(p-AMBA)。衍生化后的產(chǎn)物經(jīng)HPLC分離、紫外檢測器檢測[4 - 6]。

本研究在文獻(xiàn)報道方法的基礎(chǔ)上，對PMP衍生單糖和糖醛酸進(jìn)行了系統(tǒng)研究，分別考察了不同pH值、不同的檢測時間以及不同的反應(yīng)時間對于單糖和糖醛酸衍生反應(yīng)物的影響，并利用優(yōu)化的方法測定了細(xì)菌多糖中的單糖和糖醛酸組成。為進(jìn)一步對細(xì)菌多糖的生理活性研究提供理論依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Waters Alliance 2695高效液相色譜系統(tǒng)(美國，Waters公司)，含Waters 2998二極管陣列檢測器和Empower 3色譜工作站；集熱式恒溫加熱磁力攪拌器(杭州惠創(chuàng)儀器設(shè)備有限公司)。

1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、D -甘露糖、D -葡萄糖醛酸、D -葡萄糖、D -半乳糖、D -木糖、D -巖藻糖和乙腈均為色譜純，購于Sigma公司；KH2PO4、HCl、NaOH、三氯甲烷均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。實驗用水為超純水。

細(xì)菌多糖樣品：EnterobactercloacaeZ0206細(xì)菌由本課題組分離、馴化、鑒定并保存[8]。該細(xì)菌分泌的多糖經(jīng)過醇沉烘干為該研究所用的樣品。

1.2 實驗方法

1.2.1單糖和糖醛酸衍生物的制備精確稱取20 mg左右甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和巖藻糖，溶解于水中并定容，配制成甘露糖濃度為1 mmol/L，葡萄糖醛酸濃度為0.5 mmol/L，葡萄糖濃度為2 mmol/L，半乳糖濃度為2 mmol/L，巖藻糖濃度為1 mmol/L的混合標(biāo)樣。取10～200 μL混合標(biāo)樣于2 mL 離心管中，用水補(bǔ)足至200 μL，每支離心管中再加入50 μL 1 mmol/L木糖。依次加入50 μL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液和50 μL 0.3 mol/L NaOH溶液，蓋上蓋子，70 ℃水浴反應(yīng)60 min，冷卻后加入50 μL 0.3 mol/L HCl中和。先用0.5 mL三氯甲烷萃取兩次(用移液槍從底部取出三氯甲烷，棄去)，再用1 mL三氯甲烷萃取1次，8 000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行HPLC分析。以葡萄糖為例，單糖與PMP衍生的反應(yīng)方程式[9]如圖1所示。

圖1 葡萄糖與PMP的反應(yīng)方程式Fig.1 Labeling reaction of glucose with PMP

1.2.2細(xì)菌多糖的水解精確稱取25 mg左右細(xì)菌多糖樣品于水解管中，加入4 mL 3 mol/L三氟乙酸，再加入625 μL 10 mmol/L木糖溶液。封管，并在120 ℃烘箱中水解1 h。之后取出冷卻至室溫，調(diào)節(jié)pH值略偏堿性(用pH=1～12試紙比對)，并用水定容至25 mL。衍生反應(yīng)：取定容后的樣品溶液200 μL，之后操作同標(biāo)準(zhǔn)樣品。

1.2.3色譜條件色譜柱：XBridgeTMC18柱(250×4.6 mm，5 μm)；流動相：50 mmol/L KH2PO4溶液(pH=5.5)-乙腈(體積比78∶22)；檢測波長：245 nm；流速：1 mL/min；進(jìn)樣體積：10 μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 細(xì)菌多糖水解條件的優(yōu)化

文獻(xiàn)報道樣品水解時間通常選擇為2 h[10 - 11]或者8 h[12]。在本研究中對樣品水解時間進(jìn)行了考察，當(dāng)水解溫度設(shè)定為120 ℃，用3 mol/L 三氟乙酸分別水解樣品1 h和2 h，發(fā)現(xiàn)其色譜峰面積沒有太大的變化。最終，選擇的樣品水解時間為1 h。另外，為了避免三氟乙酸對分析結(jié)果的影響，文獻(xiàn)一般采用氮吹的方法去除三氟乙酸[13 - 14]。而在本研究中，直接用NaOH溶液中和樣品水解液中的三氟乙酸，調(diào)節(jié)pH至略偏堿性。本研究省略氮?dú)獯蹈伤庖翰襟E，直接中和，中和溶液直接進(jìn)行PMP衍生化，這對于開發(fā)快速定量單糖組成很有意義。

2.2 衍生反應(yīng)酸度的選擇

文獻(xiàn)報道[15]，為降低糖的PMP衍生物在萃取溶劑三氯甲烷中的損失，需要將衍生反應(yīng)體系的pH值調(diào)節(jié)成酸性，本研究調(diào)節(jié)pH值在2～11之間，以考察不同的衍生體系的pH值對萃取效果的影響，結(jié)果見圖2。當(dāng)pH值在2～8時，單糖-PMP衍生物的峰面積變化并不明顯，此現(xiàn)象說明pH值在2～8之間，衍生物穩(wěn)定存在，并且不會對三氯甲烷的萃取效果產(chǎn)生影響。并不需要用過量的酸使該體系的pH為3～4[16]或4～5[14]。但是當(dāng)pH值繼續(xù)升高時，葡萄糖、半乳糖和木糖三種糖衍生物的峰面積變小，此現(xiàn)象說明在較高pH值時，可能是由于部分單糖的PMP衍生物在三氯甲烷中有一定的溶解度造成在萃取過程中損失，這與文獻(xiàn)報道[16]一致。因此，本研究確定調(diào)節(jié)pH值在2～8之間，擴(kuò)大了pH的范圍，以便于實際操作。

2.3 衍生反應(yīng)時間的選擇

參考文獻(xiàn)方法[4]，設(shè)定衍生溫度為70 ℃，本研究考察了衍生時間對于各單糖和糖醛酸衍生化產(chǎn)率的影響。取甘露糖濃度為1 mmol/L，葡萄糖醛酸濃度為0.5 mmol/L，葡萄糖濃度為2 mmol/L，半乳糖濃度為2 mmol/L，巖藻糖濃度為1 mmol/L的混合標(biāo)樣160 μL。用水補(bǔ)足至200 μL，每支離心管中再加入50 μL 1 mmol/L木糖。依次加入50 μL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液和50 μL 0.3 mol/L NaOH溶液，蓋上蓋子，設(shè)定溫度為70 ℃分別衍生10、20、30、40、60和80 min。再按實驗步驟進(jìn)行處理，HPLC進(jìn)行分析。實驗結(jié)果表明：在反應(yīng)初期隨著反應(yīng)時間的延長，各單糖和糖醛酸的PMP衍生物峰面積不斷增加。當(dāng)反應(yīng)時間為60 min時，再增加反應(yīng)時間，色譜峰面積與60 min時基本持平(圖3)。因此，選擇衍生時間為60 min，這與文獻(xiàn)報道的趨勢基本一致[4]。

圖2 單糖和糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品PMP衍生物不同pH值下的峰面積Fig.2 Peak areas of PMP-labeled monosaccharides and galacturonic acid under different pH value

圖3 反應(yīng)時間對5種單糖和糖醛酸-PMP衍生物峰面積的影響Fig.3 Effect of reaction time on the peak area of PMP-labeled monosaccharides and galacturonic acid

2.4 衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性考察

為了考察5種單糖和葡萄糖醛酸的衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性，本研究考察了衍生物日內(nèi)和日間的保留時間以及峰面積的變化。實驗結(jié)果表明，在反應(yīng)結(jié)束后的48 h內(nèi)單糖和糖醛酸的衍生物峰日內(nèi)保留時間的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)≤0.32%，日內(nèi)峰面積RSD≤2.96%，日間保留時間RSD≤0.47%，日間峰面積RSD≤2.58%。因此，在48 h內(nèi)分析衍生物完全可以得到準(zhǔn)確的實驗結(jié)果，見表1。

表1 單糖和糖醛酸標(biāo)準(zhǔn)品PMP衍生物分析的日內(nèi)和日間精密度(n=6)Table 1 Precision for the analysis of PMP-labeled monosaccharides and galacturonic acid(n=6)

2.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

圖4 5種單糖和1種糖醛酸-PMP衍生物的色譜圖Fig.4 Chromatogram of PMP derivatives of 5 monosaccharides and galacturonic acid

分別取10、20、40、60、80、100、120、160及200 μL混合標(biāo)樣于2 mL離心管中，然后分別用水補(bǔ)足至200 μL，每支離心管中再加入50 μL 1 mmol/L木糖，再加入50 μL水。按實驗方法進(jìn)行衍生化并進(jìn)行HPLC分析，色譜圖見圖4。

在系列濃度下，以單糖和糖醛酸濃度與木糖濃度比值為橫坐標(biāo)，以單糖和糖醛酸峰面積與木糖峰面積比值為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得線性方程與相關(guān)系數(shù)，以3倍信噪比計算得到4種單糖和糖醛酸的檢出限，結(jié)果見表2。由此可見，本方法的線性范圍寬，檢測靈敏度較高。

2.6 單糖及糖醛酸的回收率分析

通過對細(xì)菌多糖樣品水解產(chǎn)物進(jìn)行衍生化，再對衍生物進(jìn)行3次平行分析。得到甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和巖藻糖含量比為：1.77∶0.44∶8.52∶1.32∶1.67，精密度分析范圍為0.52%～3.12%(表3)。以細(xì)菌多糖為材料進(jìn)行方法的加標(biāo)回收率考察?；旌蠘?biāo)樣分3個濃度梯度加入到樣品中，進(jìn)行測定，結(jié)果如表3所示。甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和巖藻糖的平均加標(biāo)回收率分別為88.0%、89.3%、100.3%、95.8%和94.7%，RSD分別為6.56%、6.67%、2.66%、7.42%和7.05%。表明方法的準(zhǔn)確度和精密度可以滿足細(xì)菌多糖中單糖和糖醛酸的測定要求。

表2 回歸方程、線性范圍及檢出限Table 2 Calibration curves and detection limits of 4 monosaccharides and galacturonic acid

表3 方法的加標(biāo)回收率與精密度(n=3)Table 3 The recoveries and RSD of present method(n=3)

3 結(jié)論

綜上所述，本實驗建立了細(xì)菌多糖中單糖和糖醛酸的PMP柱前衍生化-高效液相色譜測定法。實驗優(yōu)化了衍生條件，整個實驗前處理步驟中避免了氮?dú)獯蹈?、水解產(chǎn)物干燥等過程，并且擴(kuò)大了衍生化pH值范圍。結(jié)果表明該方法準(zhǔn)確、簡單、快速，具有良好的重現(xiàn)性。應(yīng)用該方法成功分離并定量分析了細(xì)菌多糖中4種單糖和1種糖醛酸。

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