多壁碳納米管修飾玻碳電極上綠原酸催化氧化谷胱甘肽

黃 穎*， 陳 美

(福建師范大學(xué)化學(xué)與材料學(xué)院，福建福州 350007)

還原型谷胱甘肽(GSH)由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸組成，它是生物體內(nèi)重要的含巰基活性物質(zhì),具有抗氧化、解毒、防輻射等功效[1]，其含量的改變與阿爾茨海默氏癥、癡呆、肌肉萎縮癥等多種疾病有關(guān)[2]，因此尋找一種快速、簡便測(cè)定GSH的方法具有重大的意義。目前檢測(cè)GSH的方法有高效液相色譜法、熒光法、毛細(xì)管電泳法、光譜法和電化學(xué)法等[3 - 7]。其中，電化學(xué)法因其具有設(shè)備簡單、操作方便、響應(yīng)迅速等優(yōu)點(diǎn)已成為測(cè)定GSH的一種重要方法。但GSH在常規(guī)電極上有較高的過電位且電子轉(zhuǎn)移速率較慢，導(dǎo)致其直接電化學(xué)測(cè)定困難，因此本文提出以綠原酸(CGA)為電催化媒介對(duì)GSH進(jìn)行間接電化學(xué)測(cè)定。

多壁碳納米管(MWCNTs)因具有較高比表面積、良好導(dǎo)電性和生物相容性等優(yōu)點(diǎn),已在電化學(xué)傳感器方面得到廣泛應(yīng)用[8 - 10]。納米Au具有金屬導(dǎo)電性、催化活性及納米材料的量子尺寸效應(yīng)，被廣泛應(yīng)用于修飾電極[11]。本文合成了納米Au-MWCNTs復(fù)合材料，并制備了Au-MWCNTs/GCE修飾電極。在該電極上以CGA為電催化媒介對(duì)GSH進(jìn)行測(cè)定，與已報(bào)道的電化學(xué)方法[12 - 13]相比，本文所提出的方法具有檢測(cè)限低、電極穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

CHI660D型電化學(xué)工作站(上海辰華儀器有限公司)；pHS-3C型精密pH計(jì) (上海大普儀器有限公司)；KQ-218型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；三電極體系：玻碳電極(GCE)或修飾電極為工作電極,Ag/AgCl(飽和KCl)為參比電極,鉑絲電極為輔助電極。

還原型谷胱甘肽(GSH，Sigma公司)；綠原酸(CGA，上海麥克林試劑公司)；HAuCl4、NaBH4、檸檬酸鈉(百靈威化學(xué)技術(shù)有限公司)；多壁碳納米管(MWCNTs)(>95%,深圳納米技術(shù)有限公司)；其余試劑均為分析純。實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2 MWCNTs的純化

將50 mg MWCNTs 置于60 mL體積比為3∶1的HNO3與H2SO4混酸中，超聲混合3 h，加入適量蒸餾水稀釋，溶液冷卻后抽濾，用蒸餾水洗滌至中性，然后在85 ℃下真空干燥12 h，得含氧功能團(tuán)的MWCNTs。

1.3 Au-MWCNTs的制備

取適量的HAuCl4溶解在0.1 mol/L HCl中,并與一定體積的檸檬酸鈉溶液混合攪拌，形成檸檬色溶液，再加入到純化后的MWCNTs的圓底燒瓶中攪拌，將一定濃度的 NaBH4逐滴加入到圓底燒瓶中攪拌，用NaOH調(diào)節(jié)溶液pH為13，緊接著將混合溶液在90 ℃下攪拌回流6 h后，在10 000 r/min下離心分離，洗滌，最后在80 ℃下干燥12 h，得產(chǎn)品。

1.4 工作電極的制備

GCE以0.3、0.1、0.05 μm的Al2O3拋光粉依次拋光，用無水乙醇和水各超聲清洗3 min后，浸入到0.5 mol/L H2SO4中，在-1.0～1.0 V電位區(qū)間以50 mV/s掃速進(jìn)行循環(huán)伏安掃描直至伏安曲線穩(wěn)定。把1 mg純化后的MWCNTs和Au-MWCNTs分別分散在1 mL DMF中，超聲20 min。將懸浮液10 μL分別滴涂在GCE表面，在室溫下干燥得到MWCNTs/GCE和Au-MWCNTs/GCE。

1.5 實(shí)際樣品分析

還原型谷胱甘肽滴眼液樣品分析是將0.1 g GSH溶解在5 mL指定溶液中，用0.1 mol/L磷酸鹽緩沖溶液(PBS，pH=6.0)將滴眼液稀釋6 500倍后，用于電分析測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 透射電鏡(TEM)表征

如圖1所示，采用TEM對(duì)純化后的MWCNTs和Au-MWCNTs復(fù)合材料進(jìn)行了表征。由圖1a可以看出，混酸處理后的MWCNTs長度較短，表面較粗糙，彼此之間的纏結(jié)較少，說明經(jīng)過混酸氧化后的MWCNTs發(fā)生了較明顯的短切現(xiàn)象。由圖1b可以看出，MWCNTs表面的Au納米粒子清晰可見，顆粒大小比較均勻，多為球型粒子，表明成功制備了Au-MWCNTs復(fù)合材料。

圖1 MWCNTs(a)和Au-MWCNTs(b)的透射電鏡(TEM)圖Fig.1 TEM images of MWCNTs(a) and Au-MWCNTs(b)

圖2 GCE(a)、MWCNTs/GCE(b)和Au-MWCNTs/GCE(c)在1 mmol/L [Fe(CN)6]4-/3- +0.5 mol/L KCl溶液中的循環(huán)伏安圖(插圖A：交流阻抗圖;插圖B:GCE(a)、MWCNTs/GCE(b)和Au-MWCNTs/GCE(c)上的Ip-v1/2關(guān)系圖)Fig.2 CVs and Nyquist plots(inset A) of GCE(a),MWCNTs/GCE(b) and Au-MWCNTs/GCE(c) in 1 mmol/L [Fe(CN)6]4-/3- +0.5 mol/L KCl solution;Inset B:plot of Ip vs. v1/2 at GCE(a),MWCNTs/GCE(b) and Au-MWCNTs/GCE(c)scan rate:100 mV/s;requency range:0.1 - 105 Hz.

2.2 電極的表征

實(shí)驗(yàn)測(cè)定了不同電極對(duì)1 mmol/L [Fe(CN)6]4-/3-(含0.5 mol/L KCl)的循環(huán)伏安(CV)響應(yīng)(圖2)。與GCE相比，Au-MWCNTs/GCE和MWCNTs/GCE上的氧化還原峰電流分別增大了3倍和2倍，且氧化還原峰電位差(ΔEp)分別減少了10和6 mV,說明Au-MWCNTs復(fù)合材料更能有效增大電極有效表面積，提高電子轉(zhuǎn)移速率。測(cè)定了不同掃速下不同電極在1 mmol/L [Fe(CN)6]4-/3-(含0.5 mol/L KCl)中的CV曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，電流響應(yīng)值(Ip)與掃速平方根(v1/2)呈良好的線性關(guān)系。由Randles-Sevcik方程計(jì)算得有效表面積A:Ip=2.69×105n3/2AD1/2v1/2c。式中:n即為[Fe(CN)6]4-/3-電對(duì)的轉(zhuǎn)移電子數(shù)且n=1,D為擴(kuò)散系數(shù)且D=7.6×10-6cm2s-1,v為掃速,c為 [Fe(CN)6]4-/3-濃度且c=l mmol/L。圖2插圖B中曲線a、b、c分別表示GCE、MWCNTs/GCE和Au-MWCNTs/GCE的Ip-v1/2關(guān)系，由對(duì)應(yīng)的直線斜率可得有效表面積分別為0.07、0.12和0.15 cm2。結(jié)果表明Au-MWCNTs復(fù)合膜能有效地增大玻碳電極有效表面積,使得電流響應(yīng)增大。

為進(jìn)一步研究電極的電化學(xué)性能，考察了不同電極在1 mmol/L [Fe(CN)6]4-/3-(含0.5 mol/L KCl)中的交流阻抗圖。如圖2插圖A所示，在GCE(a)上出現(xiàn)明顯圓弧形狀,而在MWCNTs/GCE(b)和Au-MWCNTs/GCE(c)上圓弧很小且接近直線,并且Rct(Au-MWCNTs/GCE)比Rct(MWCNTs/GCE)更小,電子在Au-MWCNTs/GCE表面有較快的傳遞速率。以上結(jié)果進(jìn)一步表明Au-MWCNTs復(fù)合材料具有優(yōu)異的電化學(xué)性能。

2.3 GSH的電催化氧化行為

測(cè)定了不同電極在不同條件下的CV曲線(圖3)。由圖可知,電催化媒介CGA在GCE(a)、MWCNTs/GCE(b) 和Au-MWCNTs/GCE(c)上都出現(xiàn)明顯的氧化還原峰,說明CGA具備良好的電化學(xué)活性。此外Au-MWCNTs/GCE(c) 上氧化還原峰電流大于GCE(a) 和MWCNTs/GCE(b) 的響應(yīng)，說明Au-MWCNTs作為修飾材料能有效放大電流響應(yīng)。在考察的電位范圍內(nèi)25 μmol/L GSH在Au-MWCNTs/GCE(d) 上未出現(xiàn)氧化還原峰,說明GSH在這種修飾電極上無明顯電化學(xué)響應(yīng)，難以實(shí)現(xiàn)對(duì)GSH的直接測(cè)定。于CGA溶液中加入GSH后,Au-MWCNTs/GCE(e) 上氧化峰電流明顯增大,還原峰減小，說明CGA對(duì)GSH有電催化氧化作用。

圖3 (A) 10 μmol/L CGA 在GCE(a)、MWCNTs/GCE(b)和Au-MWCNTs/GCE(c)上的循環(huán)伏安圖;(B) 25 μmol/L GSH(d)和加入10 μmol/L CGA后(e)在Au-MWCNTs/GCE上的循環(huán)伏安圖Fig.3 (A) CVs of 10 μmol/L CGA at GCE(a),MWCNTs/GCE(b) and Au-MWCNTs/GCE(c);(B) CVs of 25 μmol/L GSH in the absence(d) and presence of 10 μmol/L CGA(e) at Au-MWCNTs/GCEscan rate:50 mV/s.

圖4 不同pH下25 μmol/L GSH和10 μmol/L CGA在Au-MWCNTs/GCE上的循環(huán)伏安圖(插圖：pH與氧化峰電流和氧化峰電位的關(guān)系圖)Fig.4 CVs of 25 μmol/L GSH with 10 μmol/L CGA at Au-MWCNTs/GCE in 0.1 mol/L PBS with different pH(Inset:Plot of Ipa and Epa vs.pH) a-g:4.0,5.0,5.5,6.0,7.0,8.0,9.0

2.4 pH的影響

在Au-MWCNTs/GCE上，考察了25 μmol/L GSH 和 10 μmol/L CGA在不同pH的PBS中的循環(huán)伏安行為。由圖4可知，在pH=4.0～6.0范圍內(nèi)，氧化峰電流(Ipa)隨pH增加而增大，在pH=6.0～9.0范圍內(nèi)，Ipa隨pH增大而減小，GSH的Ipa在pH=6.0時(shí)最大，因此選擇pH=6.0作為最佳實(shí)驗(yàn)條件。由圖4插圖可知，在 pH=4.0～9.0范圍內(nèi)，氧化峰電位(Epa)隨pH增加而減小，其線性方程為:Epa=0.6317-0.054pH，R2=0.9920。斜率54 mV/pH與等電子等質(zhì)子傳遞的理論值59 mV/pH接近，表明Au-MWCNTs/GCE上的化學(xué)反應(yīng)是等質(zhì)子等電子的完全不可逆過程。

2.5 塔菲爾法

在Au-MWCNTs/GCE上，于0.1～0.4 V電位范圍，對(duì)15、20、25 μmol/L三種濃度GSH加入10 μmol/L CGA溶液進(jìn)行Tafel曲線測(cè)定。在0.20～0.24 V電位范圍logI與Ep呈良好線性關(guān)系,且斜率相差不大，求得Tafel平均斜率為9.9408 V-1。由于 CGA 在Au-MWCNTs/GCE上對(duì)GSH 的電催化氧化是完全不可逆的電化學(xué)過程，電荷傳遞系數(shù)α可由完全不可逆過程方程式計(jì)算:Ep=(blogv)/2+constant，式中:b即為Tafel斜率,根據(jù)b=n(1-α)F/2.303RT(溫度T=298 K,n為電子轉(zhuǎn)移個(gè)數(shù),α為電荷傳遞系數(shù),法拉第常數(shù)F=96487 C/mol)，可計(jì)算得α=0.706(假設(shè)n=2)。

2.6 計(jì)時(shí)電流法

2.7 重現(xiàn)性、穩(wěn)定性和選擇性

用同一根新制的Au-MWCNTs/GCE，在25 μmol/L GSH的含10 μmol/L CGA的0.1 mol/L PBS(pH=6.0)中平行測(cè)定8次，氧化峰電流值的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD) 為3.5%。采用同樣的方法平行制備的5根Au-MWCNTs/GCE 在上述溶液中分別進(jìn)行測(cè)定，實(shí)驗(yàn)得氧化峰電流的RSD為4.2%。將Au-MWCNTs/GCE放置在4 ℃冰箱中一周，兩周和一個(gè)月后，對(duì)上述溶液進(jìn)行測(cè)定，測(cè)得氧化峰電流分別為初始電流的95.4%、91.7%和90.3%。說明該電極的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性較好。另外，探究了一些常見干擾物對(duì)GSH測(cè)定的干擾。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)20倍濃度甘氨酸、纈氨酸、色氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、半胱氨酸和氧化型谷胱甘肽對(duì)GSH的測(cè)定幾乎不存在干擾。

2.8 線性范圍及檢測(cè)限

最佳實(shí)驗(yàn)條件下,采用差分脈沖伏安法(DPV)測(cè)定GSH在Au-MWCNTs/GCE上的線性范圍及檢測(cè)限。如圖5所示，在5.0～30 μmol/L和0.1～5.0 μmol/L范圍內(nèi),GSH的氧化峰電流(Ipa)與濃度(c)呈良好線性關(guān)系,其線性方程為:Ipa(μA)=-0.7000c(μmol/L)-20.2655(R2=0.9916,c:5.0～30.0 μmol/L,CGA=10 μmol/L);Ipa(μA)=-1.1603c(μmol/L)-18.1901(R2=0.9978,c:0.1～5.0 μmol/L,CGA=5 μmol/L)。計(jì)算得該方法的檢測(cè)限(S/N=3)為0.034 μmol/L。

圖5 (A) 10 μmol/L CGA和不同濃度GSH的0.1 mol/L PBS(pH=6.0)在Au-MWCNTs/GCE上的DPV圖(插圖：氧化峰電流與GSH濃度關(guān)系圖)；(B) 5 μmol/L CGA和不同濃度GSH的0.1 mol/L PBS(pH=6.0)在Au-MWCNTs/GCE上的DPV圖(插圖：氧化峰電流與GSH濃度關(guān)系圖)Fig.5 (A) DPVs at Au-MWCNTs/GCE with 10 μmol/L CGA in 0.1 mol/L PBS (pH=6.0)(Inset:Plot of Ipa vs.cGSH);(B) DPVs at Au-MWCNTs/GCE with 5 μmol/L CGA in 0.1 mol/L PBS(pH=6.0)(Inset:Plot of Ipa vs.cGSH)cGSH:(A)a-h:0,5.0,7.5,10,15,20,25,30 μmol/L;(B) a-f:0,0.1,0.5,2.0,4.0,5.0 μmol/L.

2.9 實(shí)際樣品的測(cè)定

在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，用DPV法對(duì)谷胱甘肽滴眼液樣品中GSH的含量進(jìn)行測(cè)定，同時(shí)進(jìn)行加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn)。結(jié)果見表1。

表1 谷胱甘肽滴眼液中GSH含量測(cè)定(n=3)Table 1 Determination of GSH in glutathione eye drops(n=3)

3 結(jié)論

本文合成了Au-MWCNTs復(fù)合材料，并構(gòu)建了Au-MWCNTs/GCE，建立了以CGA為電催化媒介在Au-MWCNTs/GCE上間接測(cè)定GSH的電化學(xué)方法。用 CV、EIS、CA、Tafel和DPV等方法研究了不同工作電極表面電化學(xué)特性，及GSH 在Au-MWCNTs/GCE上的電化學(xué)行為，優(yōu)化了實(shí)驗(yàn)參數(shù)，并得到電化學(xué)動(dòng)力學(xué)參數(shù)，繪制了GSH的工作曲線。此方法用于谷胱甘肽滴眼液中GSH含量測(cè)定，獲得較好結(jié)果。

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