Lactobacillus plantarum-12胞外多糖抑制志賀氏菌生物膜形成的研究

宋瑩龍，梁雪，宋杏，牟光慶，妥彥峰，姜淑娟，錢方，馮璐

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，遼寧大連116034）

細(xì)菌生物膜（bacteria biofilm）是指細(xì)菌為了適應(yīng)生存環(huán)境，黏附于有生命或無生命物體表面后，通過其產(chǎn)生的胞外多聚物基質(zhì)將自身包裹起來的有組織的細(xì)菌群體[1]。在自然界、某些工業(yè)生產(chǎn)環(huán)境（如發(fā)酵工業(yè)和廢水處理）以及人和動(dòng)物體內(nèi)外，絕大多數(shù)細(xì)菌是附著在有生命或無生命物體的表面，以生物膜方式生長，而不是以浮游（planktonic）方式生長[2]。與浮游細(xì)菌相比，在生物膜內(nèi)的細(xì)菌對(duì)傳統(tǒng)抗生素及宿主免疫應(yīng)答的抵抗能力最高可提升至1 000倍[3]。生物膜的形成對(duì)于食品加工而言有利也有弊，如在生產(chǎn)食醋的過程當(dāng)中，在食醋表面會(huì)由醋酸菌形成一層生物膜[4]，其對(duì)發(fā)酵用的醋酸菌有保護(hù)作用，同時(shí)又能阻止外界微生物的污染，是造醋成功的標(biāo)志[5]。同樣，在食品加工領(lǐng)域食源性致病菌的污染屢見不鮮，細(xì)菌黏附于食品，食品加工接觸面以及食品設(shè)備表面[6]，浮游細(xì)菌一旦形成生物膜后，將會(huì)變得難以被清除。因此，抑制致病菌生物膜的形成或者清除已形成的生物膜就變得極其重要。

Shigella（志賀氏菌）是常見的食源性致病菌[7]，導(dǎo)致志賀氏菌感染最主要的食品包括畜禽肉、果汁和乳制品等等。其能夠引發(fā)細(xì)菌性痢疾，造成水樣性腹瀉等癥狀[8]。近年來，在臨床上使用大量的抗生素進(jìn)行治療使得Shigella產(chǎn)生了許多耐藥性菌株。Shigella形成生物膜后對(duì)物理、化學(xué)等清洗方式有很強(qiáng)的抵抗能力，對(duì)抗生素同樣有著很強(qiáng)的抵抗作用，包裹在Shigella周圍的胞外多聚物基質(zhì)使得細(xì)菌本身被很好的保護(hù)[9]。因此其易成為在食品生產(chǎn)過程中的持續(xù)污染源，造成交叉污染以及食品加工后置處理的污染[10]。

Valle等[11]發(fā)現(xiàn)Escherichia coli CFT073分泌的K2血清型的Ⅱ型莢膜多糖能抑制很多致病菌（E.coli，Klebsiella pneumonia，Pseudomonas aeruginosa，Staphylococcus aureus，Staphylococcus epidermidis，Enterococcus faecalis）生物膜的形成[12]。Jiang 等[3]報(bào)道了其從Vibrio sp QY101中分離出的多糖A101對(duì)革蘭氏陽性及陰性細(xì)菌具有較廣的生物膜抑制能力，其中多糖對(duì)Pseudomonas aeruginosa已形成的生物膜具有清除作用，同時(shí)多糖還能夠增強(qiáng)抗生素的作用。Parrilli等[13]報(bào)道了Pseudoalteromonas haloplanktis TAC125的上清液存在抑制staphylococcus epidermidis生物膜的活性，并發(fā)現(xiàn)發(fā)揮活性作用的是TAC125的多糖成分。Alves等報(bào)道了一株[14]L.plantarum TCUESC02發(fā)酵上清液抑制了S.aureus生物膜的形成。Wang等[15]報(bào)道了L.plantarum YW32 抑制了 E.coli O157，S.flexneri CMCC，S.aureus AC1，Salmonella typhimurium S50333等致病菌的生物膜形成。

本論文以大連工業(yè)大學(xué)大連市益生菌功能特性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選保存的L.plantarum-12為研究對(duì)象，旨在獲得一種能夠抑制常見食源性致病菌生物膜形成的抑制劑或清除生物膜的清除劑，主要研究了L.plantarum-12對(duì)6常種見食源性致病菌生物膜形成的抑制作用及其可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Lactobacillusplantarum-12（分離于多寶魚腸道）由大連工業(yè)大學(xué)大連市益生菌功能特性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏，培養(yǎng)于MRS液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件37℃，18 h。

Shigella CMCC51574，Escherichia coli，ATCC25922，Staphyloccocus aureus ATCC29213，Listeria monocytogenes，salmonella，Vibrio Parahaemolyticus 由大連工業(yè)大學(xué)大連市益生菌功能特性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保藏，培養(yǎng)于LB液體培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件37℃，24 h。

MRS肉湯培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；三氯乙酸（Trichloroacetic acid，TCA）：上海滬試實(shí)驗(yàn)室器材股份有限公司；無水乙醇、甲醇、冰乙酸、二甲苯、氯化鋰：天津市大茂化學(xué)試劑廠；透析袋（截留分子量8 000 Da～14 000 Da）、左氧氟沙星：北京索萊寶科技有限公司；環(huán)丙沙星：上海阿拉丁生化科技股份有限公司；0.22 μm濾膜：上海魯汶生物科技有限公司；96孔板：蘇州康寧杰瑞生物科技有限公司；PBS稀釋液：北京陸橋技術(shù)股份有限公司；結(jié)晶紫：沈陽試三生化科技開發(fā)有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

冷凍離心機(jī)（Centrifuge 5840R）：德國艾本德股份公司；酶標(biāo)儀（Multiskan GO 1510）：芬蘭賽默飛世爾科技公司；光學(xué)顯微鏡（ECLIPSE Ci-L）：日本尼康公司；微量離心機(jī)（Micro 17）：德國賽默飛世爾科技公司；超聲清洗機(jī)（KQ5200DE）：昆山市超聲儀器有限公司；生化培養(yǎng)箱（SHP-150）：上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 L.plantarum-12胞外多糖（Exopolysaccharides，EPS）提取

活化后的L.plantarum-12（1%）接種于新鮮MRS液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)18 h。培養(yǎng)完成后取發(fā)酵液離心（8 000 r/min，10 min，4℃），除菌體保留上清液；上清液旋蒸濃縮至原體積的1/5；配置80%TCA加入上清液，使上清液中TCA終濃度為4%，室溫下?lián)u勻30 min，沉淀蛋白；離心（8 000 r/min，15 min，4℃），除蛋白保留上清液；上清液加入2倍體積冷無水乙醇，4℃放置12 h，沉淀多糖；離心（8 000 r/min，15 min，4 ℃），棄上清液保留多糖沉淀，并用適量去離子水溶解；4℃超純水中透析48 h，每8h換一次水。凍干，得EPS樣品。采用苯酚硫酸法和考馬斯亮蘭法分別測定EPS中的多糖含量和蛋白含量。

1.3.2 EPS對(duì)致病菌生物膜的影響

1.3.2.1 EPS對(duì)致病菌生物膜形成的抑制作用

采用結(jié)晶紫染色法[16]研究L.plantarum-12 EPS對(duì)致病菌生物膜形成的影響。L.plantarum-12 EPS溶于去離子水，過 0.22 μm 濾膜并配置成 0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL不同濃度EPS溶液。致病菌2%接種于LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h，取1%加入新鮮LB培養(yǎng)基進(jìn)行稀釋，取95 μL稀釋菌液加入96孔板，將5 μL不同濃度EPS溶液加入菌液（對(duì)照孔加入95 μL菌液與5 μL LB培養(yǎng)基），37℃培養(yǎng)24 h后進(jìn)行檢測。培養(yǎng)結(jié)束后，吸去每孔菌液，并用生理鹽水洗滌3次以洗去未黏附細(xì)菌，然后加入0.2 mL 95%甲醇固定菌體15 min，將平板倒空晾干，加入0.2 mL 2%結(jié)晶紫染色5 min，蒸餾水洗去多余染料，著色于菌體的染料用0.16 mL 33%冰醋酸重新溶解30 min，取125 μL加入另一干凈的96孔板中，于590 nm處測OD。

式中：OD1為EPS處理組的吸光度值；OD2為對(duì)照組的吸光度值。

1.3.2.2 顯微觀察

采用Sayem等[17]報(bào)道的方法用顯微鏡觀察生物膜形成。S.flexneri以1%接菌量接種于10 mL LB液體培養(yǎng)基中，取9.5 mL菌懸液倒入放有1×1 cm2蓋玻片的培養(yǎng)皿中，加入0.5 mL梯度濃度的EPS溶液，37℃培養(yǎng)24 h。然后取蓋玻片，用生理鹽水輕輕漂洗，以洗去未粘附菌體，接著用2%結(jié)晶紫染色5 min，用清水將多余的結(jié)晶紫洗凈，將蓋玻片置于10×40倍顯微鏡下觀察。

1.3.2.3 EPS對(duì)S.flexneri生物膜的清除作用

S.flexneri以2%接種于LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)24 h，取1%接種于LB培養(yǎng)基，取100 μL菌液加入96孔板，37℃培養(yǎng)24 h，生理鹽水清洗每孔去除未粘附菌體，加入95 μL LB培養(yǎng)基及5 μL EPS溶液（梯度濃度：0.2、0.5、1.0、2.0、4.0 mg/mL），37 ℃培養(yǎng) 24 h 后使用結(jié)晶紫染色法檢測[16]。

1.3.3 致病菌藥敏性試驗(yàn)

采用Jiang等[3]報(bào)道的方法測定喹諾酮類抗生素環(huán)丙沙星與左氧氟沙星對(duì)S.flexneri的最低抑菌濃度（Minimum Inhibitory Concentration，MIC），最小殺菌濃度（Minimum Bactericidal Concentration，MBC）及最低生物膜清除濃度（Minimal Biofilm Elimination Concentra tion，MBEC）。MIC及MBC測定，配制含有抗生素的LB培養(yǎng)基，以2倍梯度稀釋，使抗生素終濃度從1 024 μg/mL至0.031 25 μg/mL，吸取各梯度培養(yǎng)基100 μL加入96孔板，每組3平行，以空LB培養(yǎng)基為空白對(duì)照，向每孔培養(yǎng)基中加入菌液使S.flexneri終濃度達(dá)到105cfu/mL，37℃培養(yǎng)24 h后，于酶標(biāo)儀測定OD600，確定該抗生素對(duì)S.flexneri的最低抑菌濃度MIC，蘸取將未見生長孔內(nèi)的培養(yǎng)基，劃線培養(yǎng)后，確定該抗生素對(duì)S.flexneri的最低殺菌濃度MBC。

MBEC測定，S.flexneri培養(yǎng) 24 h后調(diào)濃度至107cfu/mL，將稀釋后的菌液加入到小孔中，每孔150μL，設(shè)空白對(duì)照；37℃培養(yǎng)24 h后吸去小孔中培養(yǎng)基，加入200 μL 0.9%生理鹽水，搖晃1 min，以洗去未成膜菌體，吸去每孔液體，然后加入含有梯度濃度抗生素的培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h；培養(yǎng)完成后，吸去培養(yǎng)基，加入200 μL 0.9%生理鹽水，搖晃1 min，洗去未成膜菌體，吸去每孔液體，加入新鮮LB培養(yǎng)基，每孔0.2 mL，高強(qiáng)度超聲5 min。37℃培養(yǎng)24 h使未死的S.flexneri生長至混濁，測定吸光值來測MBEC（OD600 nm＜0.1）。

1.3.4 EPS對(duì)致病菌菌體表面性質(zhì)的影響

1.3.4.1 致病菌菌體疏水性試驗(yàn)

采用Collado等[18]報(bào)道的方法測定6種常見食源性致病菌菌體疏水性。以2%接菌量接種于5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)完成后，將菌懸液離心（8 000 r/min，10 min，4℃），棄去上清液，保留菌體，加入PBS使菌體重新懸浮，調(diào)整菌懸液OD600至0.2～0.3（OD1）。取2 mL菌懸液，然后加入同體積的二甲苯或者加入同體積二甲苯及100 μL 1 mg/mL EPS溶液，震蕩30s后室溫下靜置1h分層，吸取水相200μL加入96孔板中測定OD600（OD2）。疏水性/%=（OD1-OD2）/OD1×100

1.3.4.2 EPS對(duì)S.flexneri自聚性的影響

采用Collado等[18]報(bào)道的方法測定S.flexneri菌體自聚性，1%過夜培養(yǎng)的S.flexneri接種到5 mL含有梯度濃度 EPS（0.5、1、2、4 mg/mL）的 LB 培養(yǎng)基，對(duì)照組LB培養(yǎng)基不含EPS，37℃培養(yǎng)24 h。從對(duì)照組和試驗(yàn)組菌液的上半部分吸出0.2 mL加至96孔板并測定OD600（作為渦旋前吸光度A0）。然后漩渦震蕩使菌液重新懸浮均勻，吸出0.2 mL加至96孔板測定OD600（作為渦旋后的吸光度At），計(jì)算自聚性公式：

自聚性/%=（1-A0/At）×100

1.3.5 EPS對(duì)S.flexneri胞外多聚物基質(zhì)的影響

采用Guo等[20]報(bào)道的方法提取胞外多聚物，S.flexneri以1%接種于含有梯度濃度EPS的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)24 h。離心（10 000 r/min，20 min，4℃）棄去上清液，用PBS洗菌體3次，加入5 mL 5 mol/L的LiCl溶液，37℃孵育1 h，離心得到上清液為胞外多聚物提取液。采用苯酚硫酸法與考馬斯亮藍(lán)法分別測定多糖與蛋白質(zhì)含量。

采用Kaplan[21]等報(bào)道的方法提取eDNA，S.flexneri以1%接種于含有梯度濃度EPS的LB培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng) 24 h。離心（10 000 r/min，20 min，4℃）棄去上清液，加入1 mL Tris-EDTA緩沖液（10 mmol/L Tris，1 mmol/L EDTA，pH=8），搖勻后將其轉(zhuǎn)入2 mL微量離心管中，微量離心機(jī)13 000 r/min離心30 s，棄去上清液，再加入500 μL TE緩沖液，離心后取上清液為eDNA提取液。于波長260 nm下測定樣品溶液OD值。

1.3.6 數(shù)據(jù)分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，差異顯著性檢驗(yàn)采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析（ANOVE，LSD）。所有數(shù)據(jù)均表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，p＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 胞外多糖對(duì)致病菌生物膜的影響

2.1.1 胞外多糖對(duì)致病菌生物膜形成的抑制作用

以L.plantarum-12為目標(biāo)菌株，研究其EPS抑制不同常見食源性致病菌生物膜形成的能力。結(jié)果如表1所示。

L.plantarum-12 EPS對(duì)6種致病菌生物膜的形成均有不同程度的抑制作用。當(dāng)EPS濃度為1.0 mg/mL時(shí)，EPS對(duì)E.coli，S.aureus，生物膜抑制率達(dá)到最大值（p＜0.05）分別為 46.80%，34.74%。在 EPS濃度為2.0 mg/mL 時(shí)，S.flexneri，Salmonella，L.monocytogenes生物膜抑制率達(dá)到最大值分別為53.77%，44.78%及45.48%。EPS對(duì)V.Parahaemolyticus生物膜抑制率隨著多糖濃度增大而增大，在多糖濃度為4.0 mg/mL時(shí)，抑制率達(dá)到39.09%。綜合比較，L.plantarum-12 EPS對(duì)S.flexneri生物膜形成的抑制效果較好，在EPS濃度為1.0及2.0 mg/mL時(shí)達(dá)到了50%以上的抑制率，而EPS對(duì)其他病原菌生物膜的最大抑制率均不足50%。

目前，多糖類物質(zhì)已經(jīng)被報(bào)道為一種能夠抑制病原菌生物膜形成的天然產(chǎn)物[3]。在微生物生物膜形成的 4個(gè)階段（起始黏附，發(fā)展，成熟，放散）中[23]，L.plantarum-12 EPS作為生物大分子，其進(jìn)入致病菌菌體內(nèi)部相對(duì)困難，因此推測其對(duì)于致病菌生物膜形成的抑制作用主要是因?yàn)镋PS對(duì)于菌體表面自身多糖結(jié)合位點(diǎn)起到了封閉或競爭作用[24]，阻礙了細(xì)菌菌體起始黏附以及菌體之間的聚集。接下來選擇了抑制效果較好的S.flexneri作為受試致病菌進(jìn)行相關(guān)試驗(yàn)。

在10×40倍顯微鏡下觀察了不同濃度L.plantarum-12 EPS的影響下，S.flexneri生物膜的形成情況，結(jié)果見圖1。

在未加入多糖的對(duì)照組中，S.flexneri呈團(tuán)簇狀聚集在一起，多而密集，隨著EPS濃度的增加，黏附在蓋玻片表面的菌體量有明顯的減少，不再以大量菌體連接在一起形成的菌簇呈現(xiàn)，而多以單個(gè)菌體的形式黏附于蓋玻片表面。

2.1.2 EPS對(duì)S.flexneri生物膜的清除作用

S.flexneri生物膜形成之后，加入不同濃度的L.plantarum-12 EPS溶液再進(jìn)行培養(yǎng)，這時(shí)S.flexneri生物膜的形成過程已經(jīng)進(jìn)入了成熟及放散階段。多糖對(duì)生物膜清除的效果如圖2所示。

圖2 L.plantarum-12 EPS清除S.flexneri生物膜的能力Fig.2 Different concentrations of EPS eliminated biofilm of S.flexneri

與未加入EPS的對(duì)照組相比，加入EPS進(jìn)行培養(yǎng)的孔內(nèi)生物膜的量有明顯降低，并且隨著EPS濃度的提高，生物膜的剩余量在逐漸減少，清除率逐漸增大，最高可達(dá)61.2%。推測其因?yàn)镾.flexneri形成生物膜所必需的結(jié)合位點(diǎn)被L.plantarum-12 EPS取代結(jié)合，導(dǎo)至S.flexneri無法通過自身所產(chǎn)的胞外多糖緊密連接在一起[24]；生物膜在成熟后，有些細(xì)菌菌體會(huì)自行或者在外界作用干擾的情況下脫離生物膜，也就是生物膜的放散階段[25]，EPS可能在此階段同樣發(fā)揮著作用，通過與細(xì)菌表面受體相結(jié)合，從而使菌體大量地從已形成的生物膜中脫離再次成為浮游菌體。

2.2 EPS對(duì)致病菌藥敏性的影響

為了驗(yàn)證EPS對(duì)S.flexneri生物膜的抗生素耐受性是否有影響。測定了S.flexneri對(duì)于2種喹諾酮類抗生素左氧氟沙星，環(huán)丙沙星的最低抑菌濃度MIC，最小殺菌濃度MBC及最低生物膜消除濃度MBEC，結(jié)果如表2所示。

表2 S.flexneri最低抑菌濃度，最小殺菌濃度及最低生物膜消除濃度Table 2 Antibiotic sensitivity of S.flexneri as a planktonic population（MIC and MBC）and as a biofilm population（MBEC）

兩種抗生素對(duì)S.flexneri的作用處于同一水平。在濃度為0.25 μg/mL時(shí)，兩種抗生素對(duì)于浮游狀態(tài)下的S.flexneri有著抑制其生長的作用。而如果要徹底殺死浮游狀態(tài)下的菌體，則兩種抗生素的濃度需要達(dá)到0.5 μg/mL。兩種抗生素濃度達(dá)到256 μg/mL時(shí)，可消除S.flexneri已形成的生物膜。結(jié)果表明，形成生物膜后的S.flexneri相較于浮游狀態(tài)下的菌體，耐藥能力提升了1 000倍。所以，S.flexneri一旦形成生物膜，其將會(huì)變得難已應(yīng)對(duì)。然而，在加入EPS后，抗生素對(duì)生物膜的消除能力有著顯著地提升，在64 μg/mL時(shí)，就已經(jīng)達(dá)到消除目的。EPS使S.flexneri的耐藥能力降低了75%，從而變得更易清除。Jiang等[3]發(fā)現(xiàn)，一株Vibrio sp QY101的胞外多糖對(duì)于Pseudomonas aeruginosa的抗生素耐藥性有降低作用。

2.3 EPS對(duì)致病菌菌體表面性質(zhì)的影響

2.3.1 致病菌疏水性

加入EPS后致病菌菌體疏水性變化結(jié)果見表3。

表3 多糖對(duì)不同致病菌疏水性的抑制Table 3 Inhibitory effect of EPS on the hydrophobicity of pathogen strains

如表3所示，向不同致病菌培養(yǎng)液中加入L.plantarum-12 EPS，致病菌菌體表面疏水性顯著降低（p＜0.05），其中S.flexneri疏水性下降了91.37%。以S.flexneri為指示菌進(jìn)一步研究不同濃度EPS在對(duì)其菌體疏水性的影響，結(jié)果如圖3所示。

圖3 EPS對(duì)S.flexneri疏水性抑制作用Fig.3 Inhibitory effect of EPS on the hydrophobicity of S.flexneri

發(fā)現(xiàn)隨著EPS濃度由0升至4 mg/mL時(shí)S.flexneri疏水性從26.1%下降至2.4%。在S.flexneri與EPS共培養(yǎng)的初期，由于S.flexneri疏水性的降低，從而使其更容易在液體培養(yǎng)基中呈現(xiàn)浮游狀態(tài)。細(xì)菌菌體的疏水性與其黏附及聚集效應(yīng)密切相關(guān)，EPS使致病菌疏水性降低可能是其抑制致病菌形成生物膜的因素之一。菌體在生物膜形成的第一階段起始黏附過程中，與有生命或無生命的載體表面相接處，進(jìn)而附著于表面上，菌體表面疏水性越高也就意味著其更容易發(fā)生黏附及自聚效應(yīng)，越容易形成細(xì)菌簇，這也就增強(qiáng)了其對(duì)不良環(huán)境的抵抗能力[26]。相反疏水性降低則其黏附及自聚效應(yīng)會(huì)相對(duì)降低，從而影響細(xì)菌形成生物膜。有研究表明，細(xì)菌菌體表面的疏水性多由蛋白類物質(zhì)提供，而親水性則多由多糖類物質(zhì)提供[18]。那么，加入多糖之后，多糖可能與菌體表面的某些特定部位相結(jié)合從而給菌體增加了親水性基團(tuán)，或者掩蓋了部分疏水性基團(tuán)，使菌體的疏水性降低，抑制了細(xì)菌之間的聚集，進(jìn)而抑制了生物膜的形成。

2.3.2 EPS對(duì)S.flexneri自聚性的影響

EPS對(duì)S.flexneri自聚性抑制作用見圖4。

圖4 EPS對(duì)S.flexneri自聚性抑制作用Fig.4 Inhibitory effect of EPS on the auto-aggregation of S.flexneri

如圖4所示，S.flexneri自聚性在EPS影響下逐漸降低，與對(duì)照組相比，在加入4 mg/mL EPS的LB培養(yǎng)基中S.flexneri的自聚性為16.6%，顯著低于（p＜0.05）對(duì)照組中S.flexneri自聚性27.1%。細(xì)菌的自聚性與細(xì)菌粘附能力是相關(guān)聯(lián)的[18-19]，且細(xì)菌菌體表面成分脂壁酸，蛋白，碳水化合物等與細(xì)菌自聚性也有一定的相關(guān)性，L.plantarum-12 EPS也有可能抑制了S.flexneri某些表面成分的表達(dá)，從而降低了S.flexneri的自聚性[27]。

2.4 EPS對(duì)S.flexneri胞外多聚物基質(zhì)的影響

S.flexneri生物膜胞外多聚物基質(zhì)組分測定結(jié)果如圖5所示。

在L.plantarum-12 EPS的作用下，S.flexneri胞外多聚物中EPS的含量顯著降低（p＜0.01），最低僅為對(duì)照組的5.4%。而胞外多聚物中，蛋白質(zhì)及eDNA的含量并無顯著性變化。細(xì)菌在形成生物膜的過程中會(huì)釋放大量的胞外多聚物基質(zhì)將菌體包裹起來，其中蛋白質(zhì)，胞外多糖，胞外DNA等是胞外多聚物的重要組成成分，胞外多糖等構(gòu)成了細(xì)菌生物膜的框架，相互黏連的菌體就附著于框架表面[25]。由此可見，L.plantarum-12 EPS抑制了S.flexneri形成生物膜時(shí)自身多糖的分泌，這也就使S.flexneri缺少了可以附著的框架。S.flexneri能夠分泌群體感應(yīng)信號(hào)分子AI-2進(jìn)行群體行為調(diào)控[28-29]，L.plantarum-12 EPS可能也充當(dāng)了一種信號(hào)分子對(duì)涉及S.flexneri形成生物膜的基因表達(dá)有一定的抑制作用[15]，Y.Kim等研究發(fā)現(xiàn)Lactobacillus acidophilus A4分泌的多糖對(duì)E.coli的菌毛基因表達(dá)有明顯的抑制作用從而抑制了E.coli生物膜的形成[30]。而L.plantarum-12 EPS可能抑制了S.flexneri分泌多糖基因的表達(dá)，因而抑制了其生物膜的形成。

圖5 EPS對(duì)S.flexneri胞外多聚物基質(zhì)的影響Fig.5 Influence of EPS on the extracellular polymeric substances of S.flexneri

3 結(jié)論

本研究結(jié)果表明L.plantarum-12 EPS能夠抑制6種常見食源性致病菌E.coli，S.aureus，Salmonella，L.monocytogenes，V.Parahaemolyticus，S.flexneri生物膜的形成，其中對(duì)S.flexneri菌株生物膜抑制率最高達(dá)53.24%；且EPS能夠降低S.flexneri疏水性與自聚性，抑制S.flexneri胞外多聚物中多糖的表達(dá)量；L.plantarum-12 EPS可使S.flexneri生物膜耐藥性降低75%。綜上，L.plantarum-12 EPS對(duì)于預(yù)防或清除S.flexneri生物膜有著潛在的應(yīng)用前景。其中的作用機(jī)制需要進(jìn)一步的相關(guān)研究。

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